滋补脾阴方药含药血清对内质网应激神经元损伤的保护作用及机制研

1、    滋补脾阴方药含药血清对内质网应激神经元损伤的保护作用及机制研 医学论文              本文由中国论文范文收集整理。作者：战丽彬, 钟军华, 路小光, 隋华, 韦巍【关键词】  内质网; 衣霉素; 葡萄糖调节蛋白78; 凋亡促进因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白; 小鼠内质网（endoplasmic reticulum, ER）广泛存在于真核细胞中，是蛋白质合成、折叠、运输以及细胞内钙离子储存的主要场所。

2、内质网中钙离子紊乱和未折叠蛋白质蓄积可引发内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS），发生具有保护作用的未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）。内质网应激直接影响应激细胞的转归，如修复、损伤或凋亡。神经系统许多疾病与内质网应激相关。最近的研究表明，内质网应激介导的凋亡信号传导途径可能与阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）的发病有关。本研究观察滋补脾阴方药（Zibu Piyin Recipe, ZBPYR）含药血清对由N?糖链抑制剂衣霉素（tunicamycin, Tm）引起的内质网应激的影响，以

3、探讨其神经保护机制。1  材料与方法1.1  实验药物  滋补脾阴方药由清代吴澄不居集中资成汤加味而成，由红参30 g，山药15 g，茯苓15 g，白芍15 g，丹参12 g，白扁豆15 g，莲肉20 g，石菖蒲10 g，远志10 g，檀香4.5 g，橘红9 g，甘草9 g组成，均购自大连医药集团药材公司。中药常规水煎，每毫升中药液含生药3.29 g，4 保存备用。1.2  主要试剂和仪器  达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified eagle's medium, DMEM)和胎牛血清，Gibco公司产品

4、；胰蛋白酶和TRI?Reagent，Sigma公司产品；Tm，星形孢菌素（staurosporine, STS），日本Wako公司产品；细胞毒性检测试剂盒，Roche公司产品；RNase OUT和Oligo (dt)，Invitrogen公司产品。二氧化碳恒温培养箱，Thermo Forma公司产品；台式高速冷冻离心机，Sigma公司产品；UV754紫外分光光度计，上海分析仪器总厂产品；温度梯度PCR扩增仪，Thermo Hybaid公司产品；酶标仪，美国BIO?TEKTM公司产品；凝胶成像分析系统，UVP公司产品。1.3  中药血清制备  取健康雄性SD大鼠（220250

5、 ）12只，随机分为对照组和ZBPYR组，每组6只。适应饲养3 d后，ZBPYR组给予滋补脾阴方药灌胃，10 ml/kg体质量，此剂量灌胃2次/d，连续3 d；对照组给予等体积生理盐水灌胃。于末次给药后1 h腹主动脉取血，静置2 h，2 000 r/min，4 离心15 min分离血清，离心半径为16.1 cm，56 ，30 min灭活。0.22 m滤膜过滤除菌，20保存备用。1.4  Neuro2a细胞的培养  小鼠神经瘤母细胞Neuro2a细胞株由日本北海道大学药学部野村靖幸教授惠赠。细胞常规复苏后加入培养液于5% CO2、37 培养箱培养。细胞单层长满后用终浓度为0.

6、25%胰蛋白酶37 条件下消化3 min，以13传代。培养液含90% DMEM、10%胎牛血清和1双抗。细胞长至第三代可以使用。1.5  乳酸脱氢酶释放试验  Neuro2a细胞接种后分为对照组、10空白血清组、5ZBPYR组、10ZBPYR组、15ZBPYR组、Tm（5 g/ml）组、10空白血清Tm（5 g/ml）组、5 ZBPYRTm（5 g/ml）组、10 ZBPYRTm（5 g/ml）组、15 ZBPYRTm（5 g/ml）组。细胞单层长至70时按以上分组给予相应刺激。刺激后细胞放入5CO2、37培养箱继续培养48 h后用乳酸脱氢酶（lactate dehydro

7、genase, LDH）释放试验检测LDH泄漏率。LDH实验步骤按试剂盒说明执行。LDH泄漏率为细胞上清中LDH活性与细胞总的LDH活性比值。LDH活性测定用酶标仪于490 nm处检测。另外Neuro2a细胞接种后分为对照组、STS（0.1 mol/L）组、10空白血清STS（0.1 mol/L）组、15 ZBPYRSTS（0.1 mol/L）组，待细胞单层长至70时按以上分组给予相应刺激。刺激后细胞放入5 CO2、37 培养箱继续培养48 h后检测LDH泄漏率。1.6  逆转录聚合酶链式反应  实验分组同前。细胞单层长至90时按以上分组给予相应刺激。细胞放入5 CO2、3

8、7 培养箱继续培养6 h。总RNA的提取和逆转录聚合酶链式反应。（1）收集细胞用TRI?Reagent提取总RNA。用紫外分光光度计测定A260/A280，计算RNA浓度。（2）逆转录反应。反应体系为20 l。取2 g总RNA，加二乙基焦磷酰胺（diethyl pyrocarbonate, DEPC）水至总体积为9 l，加0.5 l Oligo (dt) 12?18引物混合后，置70 变性10 min。然后加入下列成分：5×第一链缓冲液5.875 l、10 mmol/L dNTP 2 l、0.1 mol/L DTT 2 l、RNase抑制剂0.5 l和逆转录酶0.125 l，混合使反

9、应总体系为20 l。放入46 反应1.5 h，70 变性15 min，冰上5 min后进行扩增。（3）PCR反应。在0.2 ml PCR管中加入1.2  l逆转录产物、sd H2O 9 l、10 mmol/L dNTP 0.24 l、10×PCR缓冲液1.2 l、聚合酶0.12 l、上游引物（20 mol/L）0.12 l、下游引物（20 mol/L）0.12 l，总反应体系为12 l。（4）PCR产物观察。PCR产物经40丙烯酰胺凝胶电泳后，EB染色15 min，用凝胶成像系统进行拍照及图像分析，然后计算待测基因与内标磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde pho

10、sphate dehydrogenase， GAPDH)吸光度的比值。PCR反应扩增参数如下：葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78, GRP78），94 5 min，94 1 min，55 1 min，72 1 min，循环22圈，72 5 min；凋亡促进因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/EBP homologous protein, CHOP），94 5 min，94 1 min，60 1 min，72 1 min，循环25圈，72 5 min；GAPDH，94 5 min，94 40 s，58 30 s，72 40 s，循环28圈，72 5 min。引转贴于中国论文范文     关键词:损伤,保护,作用,机制,神经,对内,医学论文,滋补脾阴方药含药血清对内质网应激神经元损伤的保护作用及机制研 内容摘要:本文由中国论文