灯盏花素对体外高压致视网膜神经节细胞凋亡的影响

1、    灯盏花素对体外高压致视网膜神经节细胞凋亡的影响作者：盛艳梅孟宪丽张艺龙怡 【摘要】  目的 考察灯盏花素对体外高压诱导的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)凋亡的 影响 ，探讨灯盏细辛视神经保护作用的物质基础。 方法  用胰酶消化法将20只出生23 d的SD（Sprague-Dawley）乳鼠视网膜制成细胞悬液，接种于经多聚鸟氨酸（HA）和层粘连蛋白（LN）包被的血盖片中。培养72 h后，将覆有细胞的血盖片转入加压装置中，加入灯盏花素溶液，继续培养24、48 h，采用C

2、aspase-3蛋白免疫组化染色法及原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(Tunel-POD)法进行检测，每天观察细胞形态，同时对部分细胞行NSE染色检查。结果 细胞生长良好，NSE染色表明，85%以上的细胞为RGCs。给药组的Caspase-3蛋白阳性表达指数和凋亡指数均明显低于模型组（P0.05，0.01）。结论 灯盏花素能对抗压力诱导的RGCs凋亡，为灯盏细辛视神经保护的有效组分。 【关键词】  灯盏花素；视网膜神经节细胞培养；高眼压模型；细胞凋亡Abstract：Objective To investigate the effects of Breviscapine on

3、apoptosis of retinal ganglion cells by high intraocular pressure in vitro and explore the substantial foundation with neuroprotective effects in glaucoma of E.breviscapus.Methods  The  retinal of 20 post-natal 2-3 days Sprague-Dawley rats were dissociated into cell suspension wit

4、h trypsin digestion.The cell suspension was implated in 6-well culture plates covered with hyaluronic acid and laminin in each well.After culturing for 72 hours，glass cover were putted into the high intraocular pressure device and the Breviscapine were added to the dyeing vats,continue to culture 24

5、/48 hours.Observing the expression of Caspase-3 protein by the immuneohistochemistry method and apoptotic cells were detected by TUNEL-POD method.And some of the 5-day culture cells were identified by NSE technique.Results The cells grew very well，over 85 percent of the living cells were retinal gan

6、glion cells by NSE identification.The positive myocytes of Caspase-3 protein and the apoptosis index in the experiment were significantly lower than those in the model group(P0.05,0.01).Conclusions Breviscapine can protect retinal ganglion cells against apoptosis by high intraocular pressure，Which i

7、s the main active component of E.breviscapus with neuroprotective effects.Key words:Breviscapine；retinal ganglion cells culture；high intraocular pressure model；apoptosis视网膜神经节细胞凋亡（retinal ganglion cells，RGCs）是视神经损伤的共同通路， 目前 尚缺乏防止RGCs的有效药物。灯盏细辛Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.- Mazz.主要含有以灯盏花素为主的黄酮类、香豆

8、素类等化合物1。 研究 证实其有减少血管外周阻力，改善大脑微循环及抗血小板聚集的作用2。随着对其药理作用的深入研究，其 应用 范围正在拓展。实验发现它在青光眼 治疗 方面可以通过多种途径起到视神经保护作用34。作者对胡竹林5、段永恒6使用的培养瓶注气式加压装置加以改进,建立了更加 科学 合理的体外高眼压模型。并在考察了灯盏细辛多组分对常压下RGCs存活的基础上，用该模型进一步考察了其中灯盏花素对体外高压诱导的RGCs的影响，以明确其起视神经保护作用的物质基础，为开发研制理想的青光眼视神经保护剂提供 参考 。  1 材料 1.1 实验动物SD乳鼠（出生23 d内），兼用。由成

9、都中医药大学实验动物中心提供，合格证号：川实动管第11号。1.2 药品及试剂灯盏花素原料药，购于云南玉溪万方天然药物有限公司，批号：040501；尼莫地平注射液0.2mg·ml-1,德国拜耳公司，批准文号：国药准字J20020102；多聚鸟氨酸（Sigma公司，P-2533），层粘连蛋白（Roche公司，批号：1243217），胰蛋白酶（Gibco公司，批号：1118374），胎牛血清(Gibco公司，批号：1216472)，小牛血清(成都哈里生物有限公司，批号：20040125)，DMEM高糖培养基(Sigma公司，批号：1242226)，5-溴-2-脱氧脲苷(Brdu，武汉博士德

10、有限公司，批号：90139520)。1.3主要仪器DMIL莱卡倒置相差显微镜，CO2孵箱（SANYO MCO-15AC），奥林巴斯体式显微镜等。1.4 统计学方法实验数据采用单因素方差 分析 ，应用SPSS 12.0 统计软件进行处理。  2 方法 2.1 培养板的处理取 6 孔板，于每孔预先置入一血盖片(24 mm×24 mm)，加入0.2 mg·ml-1多聚鸟氨酸1 ml，振荡均匀，室温静置2 h后，吸弃上清液，用适量PBS液洗涤三次，加入5 g·ml-1层粘连蛋白2 ml，置37，5的CO2孵箱中过夜，备用。2.2 细胞悬液制备及接种培养

11、将乳鼠无菌条件下断颈处死摘取眼球，在体式显微镜下沿角膜剪开,钝性分离出视网膜组织。用0.125%的胰蛋白酶37下消化，30 min后加入纯小牛血清终止消化，用无菌钢筛网滤过。将滤液1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液。加入完全培养液，吸管吹打使之制成单细胞悬液。计数并调整细胞密度为1ml含5×106个细胞。将细胞悬液按每孔1 ml接种于经包被的6孔板中，培养24 h后加入5-溴-2-脱氧脲苷以抑制非神经细胞生长。2.3 高眼压模型制作及药物的加入培养 72 h 后，将覆有细胞的血盖片嵌入到自制玻璃槽内，随机分成每槽6张，各槽内含不同受试药（灯盏花素、尼莫地平用

12、无血清培养液配制）的完全培养液25 ml，模型对照组加入等体积的培养液。然后按自行设计的加压装置进行培养，使压力达到10.64 kPa。另设正常对照组（压力为0），保持24 h后作Caspase-3蛋白免疫组化检测，48 h后进行凋亡检测。2.4 形态学观察应用倒置相差显微镜每天观察细胞形态及生长情况。2.5 RGCs鉴定7终止培养后，取两张覆有细胞的血盖片做抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组化染色检查。2.6 Caspase-3蛋白免疫组化染色检测采用链霉素-生物素复合物（ABC）技术进行检测。血盖片用 90%乙醇固定10 min，PBS洗三次，每次2 min。迈新S-P试剂盒（羊抗兔鼠

13、）A清除非特异性物质阻断过氧化物酶活性，37孵育10 min。迈新S-P试剂盒B血清封闭，37孵育10 min，沥去血清，滴加标记一抗Caspase-3 37孵育60 min。沥去PBS，加生物素标记二抗（IgG）迈新试剂C，37孵育10 min。沥去PBS，加链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液，迈新试剂D，37孵育10 min 。沥去PBS，新配制的显色剂DAB，显色35 min。以上每步之间均用PBS漂洗三次，每次5 min。采用阳性表达指数（高倍镜下，阳性细胞占同一视野细胞总数的百分比表示）作为阳性表达的定量指标，每张血盖片随机选5个阳性表达明显的视野，求其平均值。2.7 原位末端脱氧核苷酸转

14、移酶标记法采用TUNEL-POD法进行检测。血盖片用90%乙醇固定30 min，风干。通透处理用0.1% TritonX-100,室温孵育10 min。PBS冲洗2次，搽干样品周围的水，滴加50 l 的TUNEL 反应混合液，湿盒中37孵育60 min。0.3%H2O2：甲醇液，室温孵育2 min。加入50 l转化剂-POD，湿盒中37孵育30 min。加入50 l DAB底物溶液，室温孵育10 min致凋亡细胞棕黄色出现。以上每步之间均用PBS漂洗三次，每次5 min。采用凋亡指数（ 计算 同阳性表达指数）作为细胞凋亡的定量指标。  3 结果 3.1 形态学观察视网膜神经

15、细胞培养24 h开始贴壁，24 h后细胞呈圆形或椭圆形，部分细胞有聚集现象，多数细胞已经开始伸出短而小的突起，见图1。加入5-溴-2-脱氧脲苷后见少量细胞溶解坏死。48 h后细胞体积增大，突起伸长，且突起之间相互连接成网状。72 h后细胞突起生长达到峰值，长度为胞体的数倍，见图2。5d后细胞总数开始减少。加压固定48 h后模型组与正常对照组比较，可见细胞胞体缩小，核固缩，甚至出现空泡样改变，见图3、4。3.2 RGCs鉴定85%以上圆形细胞及其细长突起抗NSE染色阳性,可确认为RGC。3.3 视网膜神经细胞中Caspase-3蛋白表达变化显微镜下可见胞浆呈棕黄色的Caspase-3蛋白阳性表达

16、细胞，其阳性细胞表达指数统计结果见表1。结果表明,与模型对照组比较，灯盏花素与阳性药均能明显抑制视网膜神经节细胞中Caspase-3蛋白的表达（P0.05,P0.01）。3.4 视网膜神经节细胞凋亡情况显微镜下可见胞核被染成棕黄色的凋亡细胞，各实验组对视网膜神经节细胞凋亡指数的 影响 ，见表2。结果表明,与模型对照组比较，灯盏花素及阳性药均能明显对抗体外高压诱导的RGCs凋亡（P0.05）。表1 各组对Caspase-3蛋白阳性表达指数的影响表2 各组对视网膜神经节细胞凋亡指数的影响  4 讨论 常用的实验性高眼压动物模型虽能较好的模拟青光眼高眼压环境，真实的反映压力对RG

17、Cs的影响，但无法对RGCs在压力作用下的生长情况进行全程观察。而采用RGCs体外加压培养的 方法 就能够解决这些 问题 。 目前 国内外常用的加压培养装置多为注液式加压，容易造成缺氧或增加污染机会。本实验采用的自行设计的加压培养装置是在前人基础上加以改进而成的。该装置加压操作方便、可行；在不需要同时监测几十个培养瓶，减少工作量的同时，还可以节约大量的培养及检测试剂，减少细胞用量，从而大大降低了实验成本；同时可以监测压力，保证了更多的样本可以在相同环境下造模，尽量减少了实验误差。采用该培养模型混合培养RGCs，不仅有利于视网膜神经节细胞生长，而且用它进行RGCs损伤 研究 ，更接近于整体条件下

18、的反应情况。本实验在建立视网膜神经节细胞体外加压培养体系的基础上，考察了灯盏细辛对压力诱导的RGCs凋亡的影响，并明确了其起效成分。其中灯盏花素原料药为含灯盏乙素达85%以上的粗提取物，实验中还发现当灯盏花素浓度（0.125 mg.ml-1）为灯盏细辛总黄酮浓度（10 mg.ml-1）的近八十分之一时仍呈现出相似的药理活性，说明分离有效成分能提高药效和减少用药量。由于压力对体外培养的RGCs的影响还鲜有 文献 报道，尤其是关于药物对压力诱导细胞凋亡的保护更是罕见报道，将改进后的这种高眼压模型 应用 于细胞水平的药物筛选将具有重要意义。【 参考 文献】 1张卫东，陈万生，王永红，等.灯盏花黄酮苷化学成分的研究J.中草药，2000，31（8）：565566.2吕琳，金毅，朱宇明，等.灯盏细辛的研究进展J.中草药，1996，27卷增刊：238240.3朱益华，蒋幼芹，刘忠浩，等.灯盏细辛注射液对鼠实验性高眼压视神经轴浆运输的影响J.中华眼科杂志，2000；36（4）：289