挥发性酸Isp技术回收蛋白质的理论研究

1、挥发性酸Isp技术回收蛋白质的理论研究本章主要选取co工作为挥发性酸对角糜废水中蛋白质的沉淀规律进行研究，Ji对彩响发门质沉淀的H团盟求号察,为了进出犷大此法的话用范I丸拟果小CO二挟带乙酸的方法降低溶液的pH值，最后采用响应面优化法对挟带条件进行优化.4.2材料与仪器4.2.1实验材料试验样品；完整蓝帽鱼.由舞祥集团梃供.试验试剂；冰乙酸、氢氧化伴h溟甲酚编甲基红*酚酗、碱酸钾、无水磕酸铜、硼酸、邻茉二甲酸氢钾、柠檬酸等均为市售分析纯或优级纯；牛血清蚩白购自美国sigma公司，血泳纯：CO、盐酸为市但，常见规格；丙烯醋胺等电泳试剂均为心包.常见规格.各试液配制方式参照各检测标准进行.实验室自

2、制梅特勒-托利多仪器有限公司上海安亭科学仪器厂上海安亭科学仪器厂上海精密科学仪器仃限公司天津市泰斯符仪器有限公司北京忠昌信科技有限公司4.2.2实验设备压力设备电子犬平PL203型台式离心机TGL-16B型TDL-4型雷磁pH计PHS-2F型电子调温电热套98-1.B型分光光度计720()型实验室压力设备装置图及实物图参考第三章3.4,实骁前先通入CO.气体,方面将管路及缓冲罐、测H林的空气排出.外方面将管路中她部的水气排净，打开夹套循环水，像测量釜加入适时的伯糜陵水祥品，安装pH探头.并通过阀体控制CO2的压力，待传质稳定后读出示数即可。1.1.1 3研究方法1.1.2 3.1压力对鱼糜废水

3、pH的影响操作步骤：首先用pH计测定样品初始pH值,取50ml样品加入已经用CO?排气过的测量罐,接通设备电源,将校准后的pH计安装到测量釜上,调节进气阀，使CO2缓慢压入测辰罐，待示数稳定，记录此时压力对应的pH值，一般记录步长开始为O.IMpa,在而IMpa后可以适,与增加步长至0.2Mpa,当压力达到3Mpa时线基本能走平，实验结束；缓慢打开放阀，待测后犍压力降低至常压，卸卜.pH探头，打开排液阀，将样品液排出，每次测完需要用蒸储水冲洗干净，待下次使用。1.1.3 （?02比0体系影响回收效果的因素考察（1）鱼糜废水浓度对体系pH值的影响考虑到在实际生产中排放废水的浓度不尽相同，实验选取

4、不同浓度蛋白含质的鱼糜废水对体系的压力pH值曲线进行了考察,具体浓度分别选取Omg/mk2mgy'mR4mg/mk7mg/mk10mg/mR15mg/mk20mg/ml时对其规律进行了研究。为了进一步考察样品浓度对体系的影响，采用常/甘作标准蛋白的牛血清蛋白来液作为样品，对不同浓度的牛血清蛋白的压力pH值曲线进行了考察，具体浓度百分比分别选取0%、0.5%、1%、2%、3%时对其规律进行了研究。（2）温度对体系pH值的影响温度的变化为体系pH值的影响较大，本次:脸:要对不同温度卜的压力pH值曲线进行了考察，具体分别在20C、30、40C时对其规律进行了研究。（3）初始pH值对体系pH值

5、的影响然后,对初始pH对体系的pH值影响进行了考察,分别取初始pH值为6.5、6.0.5.5时对其规律进行探究。（4）加样容积率为体系pH值的影响最后，对加样容积率对体系的pH值影响进行了考察,所谓加样容枳率即对f测量罐来说加样量的多少。分别取初始pH值为50ml、60mL70ml时对其规律进行探究。1.1.4 挟带酸法对回收效果的影响当鱼糜废水浓度过高时，单一的CO2作为挥发性酸的ISP技术不能使溶液的pH值达到其蛋白质等电点时，采用挟带酸法来改善蛋白回收效果，以扩大此法适用范围.具体操作为:待C02排出缓冲釜与测冰釜的空气后,在用冲釜内加入乙酸，以六角螺母空封，在co?经由缓冲釜的时候，通

6、过乙酸的挥发与扩散,IhCO2将K带入测量釜，共同改变其压力和溶液的pHfl'Lo其他操作同co?对纯水体系pH值影响的步骤。1.1.5 影响挟带挟带效果的单因素考察（1）乙酸浓度对挟带效果的影响分别考察了0%、25%、50%、75%、100%时候的乙酸浓度对挟带效果的影响。（2）挟带温度对挟带效果的影响分别考察了20、35C、50C、65380c时的温度对挟带效果的影响。（3）挟带时间对挟带效果的影响分别考察了Omin、5min、10min、15min、20min时的混合时间对挟带效果的影响.1.1.6 响应面法对挟带酸影响因素的优化选取挟带酸浓度、挟带温度和挟带时间三个因素进行中心

7、组合设计，利用响应面法对乙酸挟带效果进行了优化.利用DesignExpert软件,建立三个因素与表征携带能力的参数pH值之间的二次多项式数学模型。因为在压力较大时候压力的改变对pH值的变化很小，而压力的增大势必带来高额的花费，所以目标是在较低压力卜.能达到较好的酸化效果，因此，除了选取终点压力3Mpa外，再多添加0.6Mpa和IMpa两个点来考察，对挟带效果分别优化。4.4结果与分析4.4.1 CO?的ISP基本规律4.4.1. 1压力对CO?溶解度的影响CO?在加压卜溶入水溶液体系会形成弱酸H£Ch,而正是由PH2cO；电离出的H使得溶液具有酸性。在给定温度和压力卜二CO?会在气液

8、两相达到平衡，CO2压力愈大，CC>2在水中的溶解量愈大，因此，Pcs直接反应了溶液中co,的溶解特性。随着PCO2的升高，水溶液的pH值与溶液中所含CO?组分含量的变化趋势联本相同。PCO2升高时，H2c含质直线增大，HCO/含质则微微增多，而溶液中CO,的含状迅速减少，水溶液的pH值缓慢降低，如示意图4.2所示。相对百分含量 A二 压力图4.2CO2.H2O体系随压力变化各组分变化示意图4.4.4.2压力对体系pH的影响以鱼糜废水为样品，对其不同压力卜的pH值考察得到结果如图4.3。通过图4.4可以看到：初始pH值约为7.0的鱼糜废水，其pH值的变化受CO2压力的改变开始低压时影响较

9、大，0.4Mpa内速率变化大，0.4Mpa时，pH值约为5.9,，加大压力，样品的pH值变化较为缓慢，当达到所考查最大压力3Mpa时，样品的pH值可达5.0左右。4 5压力（MPa）43鱼糜废水在不同压力卜的pH变化曲线4. 4 3各影响因素对压力-pH关系的影响（1）对不同浓度的鱼糜废水（Omg/mR 2 mg/mR 4 mg/ml、7 mg/mk 10 ing/ml、 15 mg/ml、20 ing/ml 浓度时）压力-pH f|*L关系如图 4.4.压力（MPa）nlmlmlmlg/ng /ng g grnm mgm m m0rr5lr Jn2 4 7 1 14.4不同浓度鱼糜废水的压力

10、-pH值关系通过上图可以看到每条曲线都具有相同的趋势;而且通嘤废水浓度越大时，在相同压力下pH的减小程度越小：化.糜废水浓度越低，在低压卜的pH变化越明显。当浓度为Omg/ml时,即样品为蒸为水时，其初始pH值约为6.7.其pH值的变化受CO?压力的改变明显较大，尤其在低压下，0.4Mpa内速率变化大，0.4Mpa时，pH值约为4.3,继续加大压力，样品的pH值变化较为线慢，当达到所考查最大压力3Mpa时，样品的pH值可达3.5以卜，因此，推断蛋白质浓度对最终pH值的改变程度具仃重大影响。为了进一步排除蛋白种类影响，采用常作为标准蛋白的牛血清蛋白进行了考察，结果如图4.5。可以看出，用牛血清蛋

11、白的实验结果与鱼糜废水结果类似。但与文献中齐祥明”等人对CO?乙都水体系中不同浓度卜牛血清蛋3岁压力改变规律稍有不同，其认为在牛血清蛋白等电点附近由r蛋白质的缓冲作用会出现一个缓冲平台，导致在图形上显示为pH值在降低至牛血清蛋白等电点时会变化变慢，临近点变化减小,而所得结果从上图可以看到并没仃出现明显的平台出现.认为可能由体系的不同和实验设备及检测灵敏度的不同.4.5不同浓度牛血清蛋白的压力PH值关系总之，仅糜废水的浓度对PH值随压力改变的影响较大，并旦如笫一章所由于生产上排出的鱼糜废水浓度普遍在7rmi/mg,结合图4.4可以看出单一的加压CO2法很难达到其等电点而沉淀处理。（2）温度的改变

12、直接影响CO?的溶解度，而且对鱼糜废水中蛋白结构也有一定影响。通过对体系不同温度下的压力"PH值考察,得到以下结果（图4.6）：4.6温度对压力-pH关系的影响r r r 203040结果我明，温度对压力pH曲线行一定影响：低祖下,相同压力时的pH值相对较低。主要原因可能由温度越高CO?的溶解度越低，故溶液的pH值越高。（3）初始pH的不同也是工业生产鱼糜废水常遇到的情况，对其压力-pH值关系考察结果如图4.7：初始pH不同时，较低初始pH的压力-pH曲线在某一特定值时的pH值较初始pH值较高时的pH低，而且从图中看而已看到初始pH值的不同对最终pH值的影响较大.VjftfipH6.

13、5晒PH6.0切始pH5.50.00.20.40.6081.01.2141.6182.02224262.83.0压Jj(MPa)4.7 初始pH不同对压力-pH曲线的影响i22 2.4 2.6 2.8 3.03.01111111110.0 0.20.40.60.81.01.21.41.61.82.0压力（MPa）6.5 n（4）最后对测晶罐加样容积率对压力-pH曲线的影响进行研究，结果如图4.8。以水为研究对象，对其不同测量最进行考察，可以看出以本实验中100ml容积的测最釜，加样容积率的影响很不明显，加入50ml样品时压力-pH曲线稍好，而考虑到探头自身的长度，最终实验选取50ml的样品加入

14、最。4.8 加样量不同对压力-pH曲线的影响4.4.4挟带酸下压力与pH的关系压力（MPa）一无挟带一乙取挟带 60-4.9 乙酸挟带法对鱼糜废水压力-pH曲线的影响从图4.4中已经知道，单一CO?很难使鱼糜废水的pH值达到其含蛋白质的等电点，以乙酸作为挟带酸，CO?作为我气，通过前者的挥发扩散，在后者的挟带卜进入样品中，最终得到初步压力-pH关系如图4.9。虽然挟带乙酸方法具有一定的效果.可以降低0.5个pH，单位,但即使这样也不能达到鱼糜废水中主要蛋白群的等电点,效果没有想象中那么好，因此需要对其进一步条件优化，使挟带乙酸方法达到最佳。4.4.5影响挟带效果的单因素考察（1）挟带温度对挟带

15、效果的影响在20、35350C、65、80c时的乙酸温度对挟带效果的影响如图4.10.可以看出挟带温度对挟带酸法影响较大，携带温度在低温卜影响较小，25C和35c时结果与无挟带时效果相差很小；而在较高温度时候，50c开始明显效果变好，65跟80C时的挟带效果基本相同，基本达到最好，可能原因：挟带乙酸与CO?在水中的电离平衡共同决定溶液的pH变化，H升高时，会使得平衡句反方向移动，所以较低挟带温度卜;最终的pH不会变化太大，而且温度过高会使得CC>2的溶解度降低：当温度达到.定，乙酸挟带最足够大时,会再次使得pH降低，此时CO2相当于我气的作用，起到的酸性气体效果微弱,主要降低pH效果。7

16、 54.10不同挟带温度对挟带效果的影响ccrcr O 5 Q 5 O 2 3 S 6 8（2）挟带酸浓度对挟带效果的影响挟带酸的浓度将“接决定着乙酸的扩散速度，而影响挟带效果，分别对0%、25%、50%、75%、100%时的乙酸浓度进行了考察,结果如图4.11人力（MPa）4.11 乙酸浓度对挟带效果的影响可以看到在室温卜，乙酸浓度越高，对乙酸的挟带效果越好。之所以出现这种效果是可能由于高浓度乙酸挥发效果好,分子扩散能力强，能使CO2挟带更多的乙酸分子,从而降低溶液的pH值可以看到选择纯乙酸作为挟带剂能对最终pH值的降低带来明显效果。（3）混合时间对挟带效果的影响因为在工业生产中处理时间是个

17、与成本直接挂钩的重要因素，所以分别对Omin、5minx10min、15min、20inin的乙酸、CO2混合时间进行T号察，结果如图4.12。0.00.20.4060.81.01.21.41.6182.0222.4262.83.0“、力(MPa)4.12 混合时间对挟带效果的影响可以看出乙酸与CO2的混仆时间压力pH曲线具仃相似的变化趋势,混合时间越长，对挟带效果越好，但发现15min与20min的压力pH曲线基本是接近的，而11相互仃交点，两曲线也基本相近。当然，研究还发现混合时间对挟带效果的影响明&比温度和挟带乙酸浓度的影响小，但由卜其在工业生产中基本不会带来直接成本增加，所以在

18、能提高挟带乙酸发适用范用前体F应深入研究。为此,拟在F-小节通过响应面法对其适用性进行进一步优化。4.4.6响应面法对挟带酸影响因素的优化结果4.4.6.1因素水平的选取实验采用DesignExpcrt7.0软件，根据Box-Bchnkcn中心组合设计原理，结合4.4.7中的单因素试验,选取挟带温度、挟带酸浓度、反应时间3个考察因素,进行三因素三水平响应曲面分析，具体试验因素水平设计如表4.1,共17组试验,其中12组为析因点,5组为零点，零点试验进行了5次,以估计误差。表4.1挟带酸效果试验的因素与水平.水平因素-101A挟带温度(C)506580B挟带酸浓度()5075100C反应时间(m

19、in)101520分别以0.6Mpa、lMpa3Mpa的pH值作为相应值,对其不同压力下pH值的响应曲面分析试验设计方案及试验结果如表4.2。表4.2试验设计方案及试验结果试验号X,X)X；丫|Y)10005.425.124.91201-15.75225.133-1015.385.354.7540005.455.194.8550015235.084.676-1-1-15.765.485.271115215.014.680005.395.144.889-1-105.565.374.99101105.425.054.82111105.425.45.131200-15.725.185.091310-

20、15.745.125.11140005.355.094.93150005.415.154.95161105.345.074.82170115275.14.664.4.6.2模型建立及显著性分析通过对试验数据多元回归拟合，可以得到分别在0.6Mpa、IMpa、3Mpa的pH值二次多项回归模型为：Y(0.6MPa)=0.48+0.021X1+0.42X?+0.028X；2(4.2)其中Xi、X,和X项P值为0.0001<0.01为显著项，Xz项与X/、x项不显著，交互项均不明显，且R2为。.9156说明拟公程度良好.表明在压力为0.6Mpa时,乙酸的浓度对乙酸挟带效果起到主要作用，而挟带温咬和反应时间影响较小。Y(Mpa)=0.29+0.23X1+0.026X3+0.034X/(4.3)其中Xi、X和X/项P值为0.0001<0.01为显著项，X2项与X/、X5项不显著，交互项均不明显，且R?为。.8754说明拟合程度一般。表明在压力为IMpa时.乙酸的挟带温度对乙酸挟带效果起到主要作用.乙懵浓度影响次之，而反应时间影响较小。Y(3Mpa)=0.32+0.026X1+O.O38X2+O.24X3(4.4)其中X、X?和X?项P值为0.0001<0.01为显著项，X项与X2X项不显著，交互项均不明显，且屋为