第一章蛋白质化学

1、第一章 蛋白质化学蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。1）作为生物催化剂（酶）：最重要的功能2）代谢调节：胰岛素3）防御和进攻：免疫球蛋白、毒素4）物质的转运和存储：血红蛋白、铁蛋白、卵清蛋白5）运动：肌动蛋白、肌球蛋白、微管蛋白6）结构组分：角蛋白、胶原蛋白7）细胞间信息传递：受体以及整个传导途径的组分第一节 蛋白质的分子组成一、蛋白质的元素组成主要有 C（50%55%）、H（6%7%）、O（19%24%）、N（13%19%）、S（0%4%）。有些蛋白质还含微量的P、Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo

2、、I等。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%。因此，可以用定氮法来推算样品中蛋白质的大致含量。 每克样品含氮克数×6.25×100=100g样品中蛋白质含量（g%）二、蛋白质的基本组成单位氨基酸合成蛋白质的氨基酸仅20种（称编码氨基酸），最先发现的是天门冬氨酸（1806年），最后鉴定的是苏氨酸（1938年）。（一）氨基酸的结构通式组成蛋白质的20种氨基酸有共同的结构特点：1氨基连接在- C上，属于-氨基酸（脯氨酸为-亚氨基酸）。2R是側链，除甘氨酸外都含手性C，有D-型和L-型两种立体异构体。天然蛋白质中的氨基酸都是L-型。 （二）氨基酸的分类 中性 极性中性氨基酸非极性

3、疏水性氨基酸碱性酸性 非极性疏水性：甘（Gly）、丙（Ala）、脯（Pro）、缬（Val）、亮（Leu）、异亮（Ile）、甲硫（Met）极性中性：色（Trp）、丝（Ser）、酪（Tyr）、半（Cys）、天胺（Asn）、谷胺（Gln）、苏（Thr）酸性：天（Asp）、谷（Glu）酸性：赖（Lys）、精（Arg）、组（His）（三）氨基酸的重要理化性质 1一般物理性质紫外吸收特征：蛋白质溶液280nm有吸收；茚三酮反应：氨基酸与水和茚三酮反应生成蓝紫色化合物，570nm处有吸收。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质，440nm波长）吸收峰值的大小与氨基酸释放的氨量成正比。2两性解离和等电点（

4、isoelectric point, pI） 氨基酸是两性电解质，其解离度与溶液的pH有关。 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势和程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH称为该氨基酸的等电点。第二节 肽（peptide）一、肽键与肽链一个氨基酸的-羧基和另一个氨基酸的-氨基脱水形成的酰胺键称为肽键。由氨基酸通过肽键相连而成的化合物称为肽。肽键是蛋白质分子中的主要共价键。多肽链的方向性是从N末端指向C末端。肽按其序列从N端到C端命名。【特例：谷胱甘肽GSH)全名： 谷氨酰半胱氨酰甘氨酸】一般10肽以下属寡肽，10肽以上为多肽。二、生物活性肽具有特殊生理功能的肽类化合物（

5、1）谷胱甘肽（glutathione，GSH）Cys的-SH是主要功能基团，GSH是一种抗氧化剂，是某些酶的辅酶，可保护蛋白质分子中的-SH免遭氧化，保护巯基蛋白和酶的活性。（2）多肽类激素和神经肽P39第三节 蛋白质的分子结构一、蛋白质的一级结构（primary structure）一级结构描述的是蛋白质的线性（或一维）结构，即共价连接的氨基酸的序列，又称初级或化学结构。蛋白质一级结构是空间结构和特异生物学功能的基础。维持的主要化学键是：肽键二级以上的结构称高级结构或构象（conformation）。二、蛋白质的二级结构（secondary structure）指其分子中主链原子的局部空间排

6、列，是主链构象（不包括侧链R基团）。主要化学键：氢键1肽单位 肽键及其两端的-C共6个原子处于同一平面上，组成了肽单位（所在的平面称肽键平面）。蛋白质的主链骨架由许多肽键平面连接而成。2.-螺旋(-helix) 主链骨架围绕中心轴盘绕形成右手螺旋；螺旋每上升一圈是3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm；每个肽键的亚氨基氢和后面第4个肽键的羰基形成氢键，肽链中的全部肽键都形成氢键，以稳固-螺旋的结构；侧链基团位于螺旋的外侧。3.-折叠(-pleated sheet) 1）多肽链充分伸展，每个肽单元以C为旋转点，依次折叠成锯齿结构；2）氨基酸侧链交替的位于锯齿结构的上下方；3）若干条肽链或肽段平行

7、或反平行排列成片；4）通过链间羰基氧和亚氨基氢形成氢键，从而稳固-折叠的结构。4-转角（-turn）1）常发生于肽链180°回折时的转角上；2）通常由4个氨基酸残基组成，其第1个残基的羰基氧与地4个残基的亚氨基氢形成氢键，第2个残基常为脯氨酸。5无规卷曲（random coil）多肽链的主链呈现无确定规律的卷曲。6超二级结构和结构域是蛋白质二级至三级结构层次的一种过渡态构象。三、蛋白质的三级结构（tertiary structure）指一条多肽链中所有原子的整体排布，蛋白质分子 整条肽链的空间结构。维系三级结构的作用力主要是次级键（疏水相互作用、静电力、氢键等）。四、蛋白质的四级结构

8、 (quaternary structure)有些蛋白质的分子量很大，由2条或2条以上具有独立三级结构的多肽链通过非共价键相互结合而成，称为蛋白质的四级结构。构成四级结构的每条多肽链称为亚基 (subunit)，亚基单独存在时一般没有生物学功能。五、蛋白质分子中的化学键蛋白质的一级结构是由共价键形成的，如肽键和二硫键。而维持空间构象稳定的是非共价的次级键。如氢键、盐键（离子键）、疏水键、范德华引力等。第四节 蛋白质结构与功能的关系一级结构决定空间构象一级结构相似，则其功能也相似。改变一级结构可以直接影响其功能。 蛋白质分子的构象决定性质和功能 第五节 蛋白质的理化性质一、一般性质 1、紫外吸收

9、特性2、呈色反应：茚三酮反应（蓝紫色）、双缩脲反应（紫红色）、酚试剂反应（深蓝色） 3、氨基端反应 4、两性解离与等电点二、高分子性质1、蛋白质溶液是胶体溶液。稳定亲水胶体的因素：水化膜、表面电荷透析法是利用蛋白质不能透过半透膜的性质，去掉小分子物质，达到纯化的目的。大小不同的蛋白质分子可以通过凝胶过滤分开。又称分子筛层析。2、蛋白质的变性、沉淀和凝固蛋白质在某些理化因素的作用下，空间结构被破坏，导致理化性质改变，生物学活性丧失，称为蛋白质的变性（denaturation）。不改变氨基酸序列物理因素：高温、高压、紫外线、X-射线、超声波；化学因素：强酸、强碱、重金属离子、胍、尿素等。特点： 1

10、）空间结构破坏（即次级键、二硫键断裂）；2）一级结构存在（肽键存在与水解不同点）；3）立即去除变性因素出现复性；4）理化性质改变：溶解度、粘度、吸光度变化；5）功能改变： 如酶、激素失活；6）易被蛋白酶水解意义：变性消毒、灭菌 防止感染或交叉感染 防止变性保存生物制品若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) 。蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。蛋白质自溶液中析出的现象，称为蛋白质的沉淀。盐析、有机溶剂、重金属盐、生物碱试剂都可沉淀蛋白质。蛋白质变性不一定沉淀（如强酸、强碱作用

11、变性后仍然能溶解于强酸、强碱溶液中，将pH调至等电点，出现絮状物，仍可溶解于强酸、强碱溶液，加热则变成凝块，不再溶解）。凝固是蛋白质变性发展的不可逆的结果。沉淀的蛋白质不一定变性（如盐析）。第二章 核酸的化学教学目标：1.掌握DNA和RNA在化学组分、分子结构和生物功能上的特点。2.掌握DNA双螺旋结构模型和t-RNA二级结构的要点，了解核酸的三级结构。3.熟悉核酸的性质（一般性质、DNA热变性、复性与分子杂交）。4.掌握基因组的概念，原核生物和真核生物基因组的特点。了解DNA测序的原理。导入：核酸是生物遗传的物质基础。它的发现和研究进展如何？1868年瑞士青年医生Miescher从脓细胞核中

12、分离出一种含磷量很高的酸性化合物，称为核素。其继任者Altman发展了从酵母和动物组织中制备不含蛋白质的核酸的方法，于1889年提出核酸（nucleic acid）这一名称。早期核酸研究因“四核苷酸假说”的错误进展缓慢。1943年Chargaff等揭示了DNA的碱基配对规律，1944年美国Avery利用致病肺炎球菌中提取的DNA使另一种非致病性的肺炎球菌的遗传性状发生改变而成为致病菌，发现正是DNA携带遗传信息。Astbury、Franklin和Wilkins用X射线衍射法研究DNA分子结构，得到清晰衍射图。Watson 和Crick在此基础上于1953年提出了DNA双螺旋结构模型，说明了基因

13、结构、信息和功能三者之间的关系，奠定了分子生物学基础。1958年Crick提出“中心法则”；60年代破译遗传密码，阐明3类RNA参与蛋白质生物合成的过程；70年代诞生了基因重组和DNA测序生物技术，90年代提出人类基因组计划，21世纪进入后基因组时代。核酸的研究成了生命科学中最活跃的领域之一。第一节 核酸的化学组成天然存在的核酸有两类，即脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）。DNA分子是生物体的遗传信息库，分布在原核细胞的核区，真核细胞的核和细胞器以及病毒中；RNA分子参与遗传信息表达的一些过程，主要存在于细胞

14、质。一、核酸的基本组成单位核酸是一种多聚核苷酸，用不同的降解法得到其组成单位核苷酸。而核苷酸又由碱基、戊糖和磷酸组成。（一） 戊糖 DNA含-D-2-脱氧核糖，RNA含-D-核糖。这是核酸分类的依据。核糖中的C记为15。（二）碱基（base） 核酸中的碱基有两类：嘌呤碱和嘧啶碱。有5种基本的碱基外，还有一些含量甚少的稀有碱基。DNA和RNA中常见的两种嘌呤碱是腺嘌呤（adenine，A）、鸟嘌呤（guanine，G）。而嘧啶碱有所不同：RNA主要含胞嘧啶（cytosine，C）、尿嘧啶（uracil，U），DNA主要含胞嘧啶、胸腺嘧啶（thymine，T）。tRNA中含有较多的稀有碱基（修饰碱

15、基），多为甲基化的。（三）核苷是碱基和戊糖生成的糖苷。通过C1- N9或C1- N1糖苷键连接，用单字符表示，脱氧核苷则在单字符前加d。常见的修饰核苷有：次黄苷或肌苷为I、黄嘌呤核苷X、二氢尿嘧啶核苷D、假尿苷等。注意符号的意义，如m5dC。（四）核苷酸是核苷的磷酸酯。生物体内游离存在的多是5- 核苷酸（如pA、pdG等）。常见的核苷酸为AMP、GMA、CMP、UMP。常见的脱氧核苷酸有dAMP、dGMA、dCMP、dTMP。AMP是一些重要辅酶的结构成分（如NAD+、NADP+、FAD等）；环化核苷酸（cAMP/cGMP）是细胞功能的调节分子和信号分子。ATP在能量代谢中起重要作用。核苷酸是

16、两性电解质，有等电点。核苷酸有互变异构和紫外吸收。（含氧的碱基有酮式和烯醇式两种互变异构体，在生理pH条件下主要以酮式存在）二、核苷酸的连接方式RNA和DNA链都有方向性，从5 3。前一位核苷酸的3- OH与下一位核苷酸的5位磷酸基之间形成3，5-磷酸二酯键，从而形成一个没有分支的线性大分子，两个末端分别称为5末端和3末端。大分子的主链由相间排列的戊糖和磷酸构成，而碱基可看作主链上的侧链基团，主链上的磷酸基是酸性的，在细胞pH下带负电荷；而碱基有疏水性。讨论：列表说明DNA和RNA在化学组成、分子结构和生物功能方面的主要特点。第二节 DNA的分子结构一、 DNA的一级结构 (primary s

17、tucture)DNA的一级结构是指分子中脱氧核苷酸的排列顺序，常被简单认为是碱基序列（base sequence）。碱基序有严格的方向性和多样性。一般将5- 磷酸端作 为多核苷酸链的“头”，写在左侧，如pACUGA（ 5 3） 。 在DNA一级结构中，有一种回文结构的特殊序列，所谓回文结构即DNA互补链上一段反向重复顺序，正读和反读意义相同，经反折可形成“十字形”结构，在转录成RNA后可形成“发夹”样结构，有调控意义。 GCTA GTTCA CTC TGAAC AATT CGAT CAAGT GAG ACTTG TTAA DNA分子很大，最小的病毒DNA约含5000b。1965年Holley

18、用片段重叠法完成酵母tRNAala 76nt 序列测定；1977年Sanger利用双脱氧法（酶法）测定了X174单链DNA5386b的全序列。1990年实施的人类基因组计划（HGP），用15年，投资30亿美元，完成人类单倍体基因组DNA3×109bp全序列的测定。该计划由美、英、日、法、德、中六国科学家合作，于2003年提前完成，生命科学进入后基因组时代，研究重点从测序转向对基因组功能的研究。二、DNA的二级结构双螺旋(double helix) 1953年，Watson和Crick根据Wilkins 和Franklin拍摄的DNA X-射线照片（DNA有0.34nm和3.4nm两个

19、周期性变化）以及Chargaff等人对DNA的碱基组成的分析（A=T，G=C，A+G=C+T），推测出DNA是由两条相互缠绕的链形成。Watson-Crick 双螺旋结构模型如下图：1两条反向平行的多核苷酸链形成右手螺旋。一条链为5 3，另一条为3 5。（某些病毒的DNA是单链分子ssDNA）2碱基在双螺旋内侧，A与T，G与C配对，A与T形成两个氢键，G与C形成三个氢键。糖基-磷酸基骨架在外侧。表面有一条大沟和一小沟。3螺距为3.4 nm，含10个碱基对（bp），相邻碱基对平面间的距离为0.34 nm。螺旋直径为2 nm。氢键维持双螺旋的横向稳定。碱基对平面几乎垂直螺旋轴，碱基对平面间的疏水堆

20、积力维持螺旋的纵向稳定。4碱基在一条链上的排列顺序不受限制。遗传信息由碱基序所携带。5DNA构象有多态性。Watson和Crick根据Wilkins 和Franklin拍摄的DNA X-射线照片是相对湿度92%的DNA钠盐所得的衍射图，因此Watson-Crick 双螺旋结构称B-DNA。细胞内的DNA与它非常相似。另外还有A-DNA、C-DNA、D-DNA。1979年Rich发现Z-DNA（左手螺旋、螺距4.5nm、直径1.8nm）三、DNA的三级结构DNA 双螺旋进一步盘曲所形成的空间构象称DNA的三级结构。某些病毒、细菌、真核生物线粒体和叶绿体的DNA是环形双螺旋，再次螺旋化形成超螺旋；

21、在真核生物细胞核内的DNA是很长的线形双螺旋，通过组装形成非常致密的超级结构。 1环形DNA可形成超螺旋 当将线性过旋或欠旋的双螺旋DNA连接形成一个环时，都会自动形成额外的超螺旋来抵消过旋或欠旋造成的应力，目的是维持B构象。过旋DNA会自动形成额外的左手螺旋（正超螺旋），而欠旋形成额外的右手螺旋（负超螺旋）。一段双螺旋圈数为10的B-DNA连接成环形时，不发生进一步扭曲，称松弛环形DNA（双螺旋的圈数=链绕数，即T=L，超螺旋数W=0；L=T+W），但将这一线形DNA的螺旋先拧松一圈再连接成环时，解链环形DNA存在的扭曲张力，可导致双链环向右手方向扭曲形成负超螺旋（T10，L=9，W = -

22、1）。在生物体内，绝大多数超螺旋DNA以负超螺旋的形式存在，也就是说，一旦超螺旋解开，则会形成解链环形DNA，有利于DNA复制或转录。 螺旋具有相同的结构，但L值不同的分子称为拓扑异构体。DNA拓扑异构酶切断一条链或两条链，拓扑异构体可以相互转变。W的正表示双链闭环的螺旋圈在增加，W的负表示减少。L和T的正负表示螺旋方向，右手为正，左手螺旋为负；L值必定是整数。2真核细胞染色体 真核细胞DNA是线形分子，与组蛋白结合，其两端固定也形成超螺旋结构。DNA被紧密地包装成染色体来自三个水平的折叠：核小体、30nm纤丝和放射环。核小体是染色体的基本结构单位，是DNA包装的第一步，它由DNA结合到组蛋白

23、上形成复合物，在电镜下显示为成串的“念珠”状。组蛋白是富含精氨酸和赖氨酸的碱性蛋白质，其氨基酸序列在进化中是高度保守的。组蛋白有5种，H2A、H2B、H3和H4各两分子组成的八聚体是核小体核心颗粒，DNA缠绕其上，相邻核小体间的DNA称为连接DNA且结合H1。200 bpDNA的长度约为68nm，被压缩在10nm的核小体中。压缩比约为7。30nm纤丝是第二级压缩，每圈含6个核小体，压缩比是6。30nm螺旋管再缠绕成超螺旋圆筒，压缩比是40。再进一步形成染色单体，总压缩近一万倍。典型人体细胞的DNA理论长度应是180 cm，被包装在46个5m的染色体中。四、DNA和基因组1DNA分子中的最小功能

24、单位称作基因，为RNA或蛋白质编码的基因称结构基因，DNA中具调节功能而不转录生成RNA的片段称调节基因。基因组（genome）是某生物体所含的全部基因，即全部DNA或完整的单套遗传物质（配子中的整套基因）。2细菌、噬菌体、大多数动植物病毒的基因组即指单个DNA分子。最小病毒如SV40的基因组仅有5226b，含5个基因。大肠杆菌含4.6×106 bp，有30004000个基因，DNA完全伸展总长约1.3mm。原核生物基因组的特点是：结构简炼，绝大部分为蛋白质编码（结构基因）；有转录单元，即功能相关的基因常串联一起，并转录在同一mRNA（多顺反子mRNA）中；有基因重叠现象，即同一段D

25、NA携带两种不同蛋白质的信息。3真核生物基因一般分布在若干条染色体上，其特点是：有重复序列（按重复次数分单拷贝序、中度重复序和高度重复序）；有断裂基因（由不编码的内含子和编码的外显子组成）。酵母基因组有1.35×107bp，含6374个基因。人类基因组有3×109 bp，含4万个基因。第三节 RNA的分子结构RNA通常以单链形式存在，比DNA分子小得多，由数十个至数千个核苷酸组成。RNA链可以回折且通过A与U，G与C配对形成局部的双螺旋，不能配对的碱基则形成环状突起，这种短的双螺旋区和环称为发夹结构。 RNA的C2位羟基是游离的，是一个易发生不良反应的位置，它使RNA的化学

26、性质不如DNA稳定，能较DNA产生更多的修饰组分。RNA的种类、大小、结构都比DNA多样化，按照功能的不同和结构的特点，RNA主要分为tRNA、rRNA和mRNA三类。此外，细胞的不同部位还存在着另一些小分子RNA，如核内小RNA（snRNA）、核仁小RNA（snoRNA）、胞质小RNA（scRNA）等，分别参与mRNA的前体（hnRNA）和rRNA的转运和加工过程。一、转运RNA（transfer RNA，tRNA）1分子量最小的RNA，约占总RNA的15%。主要功能是在蛋白质生物合成过程中，起着转运氨基酸的作用。21965年Holley等测定了酵母丙氨酸tRNA的一级结构，并提出二级结构模

27、型。一级结构特点：核苷酸残基数在7395；含有较多的稀有碱基（如mG、DHU等）；5-末端多为pG，3- 末端都是-CCA。3tRNA的二级结构为“三叶草”形，包括4个螺旋区、3个环及一个附加叉。各部分的结构都和它的功能有关。5端17位与近3端6772位形成的双螺旋区称氨基酸臂，似“叶柄”，3端有共同的-CCA-OH结构，用于连接该RNA转运的氨基酸。3个环是二氢尿嘧啶环（D环）、反密码子环、TC环。419731975年S.H.Kim的X射线衍射分析表明，tRNA的三级结构呈倒L字母形，反密码环和氨基酸臂分别位于倒L的两端。二、信使RNA（messenger RNA，m RNA）1细胞内含量较

28、少的一类RNA，约占总RNA的3%。其功能是将核内DNA的碱基顺序（遗传信息）按碱基互补原则转录至核糖体，指导蛋白质的合成。2种类多，作为不同蛋白质合成的模板，其一级结构差异很大。真核细胞的mRNA有不同于原核细胞的特点：3- 末端有多聚A（polyA）尾，5-末端加有一个“帽”式结构,（m7 Gppp）。 3代谢活跃，寿命较短。三、核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）1约占细胞总RNA的80%。主要功能是与多种蛋白质组成核糖体，是蛋白质合成的场所。2核糖体在结构上可分离为大小两个亚基。原核细胞的rRNA有3种，23S与5S rRNA在大亚基，16S在小亚基。真核细胞有4种rR

29、NA，其中大亚基含28S、5.8S、5S，小亚基只有18S。3. 各种rRNA的一级结构中的核苷酸残基数及其顺序都不相同，且有特定的二级结构。第四节 核酸的性质一、一般理化性质1DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末；都微溶于水，不溶于一般有机溶剂。常用乙醇从溶液中沉淀核酸。2具有大分子的一般特性。分子大小可用Da、b或bp、S、链长（m）表示。一个bp相当的核苷酸平均分子量为660Da；1m长的DNA双螺旋相当3000bp或2×106Da。3两性电解质。各种核酸的大小及所带的电荷不同，可用电泳和离子交换法分离。RNA在室温下易被稀碱水解，DNA较稳定，此特性用来测定RNA的碱基组

30、成和纯化DNA。4紫外吸收，最大吸收峰在260nm处，核酸的变性或降解，吸光度A升高，称为增色效应。二、核酸的变性和复性1变性的概念在理化因素作用下，核酸的双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规线团状态的过程。变性的因素有热、酸、碱、乙醇、尿素等。变性的本质是次级键的变化。变性的结果是紫外吸收值明显增加（增色效应），DNA粘度下降，生物学功能部分或全部丧失。2DNA的热变性和TmDNA热变性过程中，紫外吸收值增高，有一个特征性曲线称熔解曲线，通常将熔解曲线的中点，即紫外吸收值达到最大值50%时的温度称为解链温度，又叫熔点（Tm）。DNA的热变性是爆发式的，像结晶的溶解一样，只在很狭窄的温

31、度范围内完成，一般在70800C之间。变性温度与碱基组成、DNA长度及变性条件有关。GC含量越高，Tm越大；DNA越长，Tm越大；溶液离子强度增高，Tm增加。3DNA的复性与分子杂交 变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新配对，恢复天然双螺旋构象，这一现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火（annealing）。影响复性速度的因素很多，如单链DNA的起始浓度、温度（最适复性温度是比Tm约低250C）、盐浓度、片断长度、序列复杂性等。分子杂交是以核酸的变性和复性为基础，只要不同来源的核酸分子的核苷酸序列含有可以形成碱基互补配对的片段，就可以形成DNA/DNA，RNA

32、/RNA或DNA/RNA杂化双链，这个现象称为核酸分子杂交（hybridization）。标记一个来源的核酸（放射性同位素或荧光标记），通过杂交可以检测与其有互补关系的DNA或RNA，这种标记的核酸称为基因探针（gene probe），也就是一段带有检测标记，且顺序已知，与目的基因互补的核酸序列。基因探针的“集成化” 就是基因芯片（gene chip）。是把已经测序的基因固定在硅片或玻璃片上制成的。在医疗诊断和科学研究中已被快速地运用。三、核酸的序列测定DNA序列是指携带遗传信息的DNA分子中的A、C、G、T的序列。分析方法主要有两种，一种是Maxam-Gilbert化学法，另一种是Sange

33、r的双脱氧法。现在一般都采用后者，其基本原理是：1用凝胶电泳分离待测的DNA片段（用作模板）。2将模板、引物、4种dNTP、合适的聚合酶置于4个试管，每一试管按精确比例各加入一种ddNTP，用同位素或荧光物质标记。3利用ddNTP可特异地终止DNA链延长的特点，4个试管的聚合反应可以得到一系列大小不等、被标记的片段。4将4个反应管同时加到聚丙烯凝胶上电泳，标记片段按大小分离，放射自显影后可按谱型读出DNA序列。在以上两种方法的基础上，通过与计算机技术和荧光技术的结合，发明了自动测序仪。目前，常用的测序策略是“鸟枪法”，形象地说是将较长的基因片段打断，构建一系列的随机亚克隆，然后测定每个亚克隆的

34、序列，用计算机分析以发现重叠区域，最终对大片段的DNA定序。第三章 酶教学目标：1掌握酶的概念和作用特点，了解酶的分类与命名。2熟悉酶的分子组成、结构与功能（单纯酶和结合酶，酶的辅因子、维生素的类别与功能，酶的活性部位，酶原激活，同工酶、变构酶和抗体酶）。3熟悉酶的作用机制。4熟悉影响酶促反应的因素（酶浓度、底物浓度、温度、pH、激活剂与抑制剂；掌握酶促反应速度的表示、米氏方程和米氏常数的意义）。5了解酶的制备与应用。第一节 概 论导入：酶学知识来源于生产与生活实践。我们祖先很早就会制酱和酿酒。西方国家于1810年发现酵母可将糖转化为酒精；1833年，Payen及Persoz从麦芽的水抽提物中

35、用酒精沉淀得到一种热不稳定物，可使淀粉水解成可溶性糖；1878年德国科学家屈内（Kuhne）首先把这类物质称为酶（enzyme，其意“在酵母中” ）。1860年法国科学家巴斯德（Pasteur）认为发酵是酵母细胞生命活动的结果，细胞破裂则失去发酵作用。1897年，Buchner兄弟首次用不含细胞的酵母提取液实现了发酵，证明发酵是酶作用的化学本质，获得1911年诺贝尔化学奖。1926年，美国生化学家Sumner第一次从刀豆得到脲酶结晶，并证明是蛋白质。1930年，Northrop得到胃蛋白酶的结晶（1946年二人共获诺贝尔化学奖）。1963年测定第一个牛胰RNaseA序列（124aa）；1965

36、年揭示卵清溶菌酶的三维结构（129aa）。一、酶的概念酶是由活细胞合成的，对其特异底物起高效催化作用的生物催化剂（biocatalyst）。已发现的有两类：主要的一类是蛋白质酶（enzyme），生物体内已发现4000多种，数百种酶得到结晶。美国科学家Cech于1981年在研究原生动物四膜虫的RNA前体加工成熟时发现核酶“ribozyme”，为数不多，主要做用于核酸（1989年的诺贝尔化学奖）。二、酶的作用特点酶所催化的反应称为酶促反应。在酶促反应中被催化的物质称为底物，反应的生成物称为产物。酶所具有的催化能力称为酶活性。酶作为生物催化剂，具有一般催化剂的共性，如在反应前后酶的质和量不变；只催化

37、热力学允许的化学反应，即自由能由高向低转变的化学反应；不改变反应的平衡点。但是，酶是生物大分子，又具有与一般催化剂不同的特点。1极高的催化效率 酶的催化效率通常比非催化反应高1081020倍，比一般催化剂高1071013倍。例如，脲酶催化尿素的水解速度是H+催化作用的7×1012倍；碳酸酐酶每一酶分子每秒催化6×105 CO2与水结合成H2CO3，比非酶促反应快107倍。 2高度的特异性酶对催化的底物有高度的选择性，即一种酶只作用一种或一类化合物，催化一定的化学反应，并生成一定的产物，这种特性称为酶的特异性或专一性。有结构专一性和立体异构专一性两种类型。结构专一性又分绝对专

38、一性和相对专一性。前者只催化一种底物，进行一种化学反应。如脲酶仅催化尿素水解。后者可作用一类化合物或一种化学键。如酯酶可水解各种有机酸和醇形成的酯。在动物消化道中几种蛋白酶专一性不同，胰蛋白酶只水解Arg或Lys羧基形成的肽键；胰凝乳蛋白酶水解芳香氨基酸及其它疏水氨基酸羧基形成的肽键。立体异构专一性指酶对底物立体构型的要求。例如乳酸脱氢酶催化L-乳酸脱氢为丙酮酸，对D-乳酸无作用；L-氨基酸氧化酶只作用L-氨基酸，对D-氨基酸无作用。3酶活性的可调节性酶促反应受多种因素的调控，通过改变酶的合成和降解速度可调节酶的含量；酶在胞液和亚细胞的隔离分布构成酶的区域化调节；代谢物浓度或产物浓度的变化可以

39、抑制或激活酶的活性；激素和神经系统的信息，可通过对关键酶的变构调节和共价修饰来影响整个酶促反应速度。所以酶是催化剂又是代谢调节元件，酶水平的调节是代谢调控的基本方式。4酶的不稳定性酶主要是蛋白质，凡能使蛋白质变性的理化因素均可影响酶活性，甚至使酶完全失活。酶催化作用一般需要比较温和的条件（37、1atm、pH7）。三、酶的分类与命名（一）酶的分类根据国际酶学委员会（International Enzyme Commission，IEC）的规定，按照酶促反应的性质，分为六大类：1氧化还原酶（oxidoreductases）催化底物进行氧化还原反应。如乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、过氧

40、化氢酶、过氧化物酶等。2转移酶（transferases）催化底物之间某些基团的转移或交换。如甲基转移酶、氨基转移酶、磷酸化酶等。3水解酶（hydrolases）催化底物发生水解反应。如淀粉酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶等。4裂解酶（lyases）催化底物裂解或移去基团（形成双键的反应或其逆反应）。如碳酸酐酶、醛缩酶、柠檬酸合成酶等。5异构酶(isomerases) 催化各种同分异构体之间相互转化。如磷酸丙糖异构酶、消旋酶等。6合成酶(ligases) 催化两分子底物合成一分子化合物，同时偶联有ATP的分解释能。如谷氨酰胺合成酶、氨基酸-RNA连接酶等。（二）酶的命名1961年，国际酶学委员会(I

41、EC)主要根据酶催化反应的类型,把酶分为6大类，制定了系统命名法。规定每一酶只有一个系统名称，它标明酶的所有底物与催化反应性质，底物名称之间以“：”分隔，同时还有一个由4个数字组成的系统编号。如谷丙转氨酶的系统名称是丙氨酸：- 酮戊二酸氨基转移酶（酶表中的统一编号是EC2.6.1.2）。乳酸脱氢酶的编号是EC1.1.1.27。第二节 酶的分子组成、结构和功能一、酶的分子组成（一）单纯酶和结合酶单纯酶是仅由肽链构成的酶。如脲酶、一些消化蛋白酶、淀粉酶、脂酶、核糖核酸酶等。结合酶由蛋白质部分和非蛋白质部分组成，前者称为酶蛋白(apoenzyme)，决定酶的特异性和高效率；后者称为辅助因子(cofa

42、ctor)，决定反应的种类和性质。两者结合形成的复合物称为全酶（holoenzyme），这两部分对于催化活性都是必需的。酶蛋白有单条肽链和多个亚基组成的。前者称为单体酶，为数不多，均为水解酶，如胰蛋白酶、核糖核酸酶、溶菌酶等；多个相同或不同亚基以非共价键连接的酶称为寡聚酶，如磷酸化酶a，3-磷酸甘油醛脱氢酶等。细胞内存在着许多由几种不同功能的酶彼此嵌合形成的多酶复合体，即多酶体系，它利于一系列反应的连续进行，如丙酮酸脱氢酶体系、脂肪酸合成酶复合体。在多酶体系中，能影响整条代谢途径方向和速度的酶称为关键酶，关键酶通常催化单向不平衡反应，或者是该多酶体系中催化活性最低的限速酶。（二）酶的辅因子酶的

43、辅助因子指金属离子或小分子有机化合物（又称辅酶与辅基）。1.金属离子 约2/3的酶含有金属离子，常见的是K+、Na+、Mg2+、Cu2+（Cu+）、Zn2+、Fe2+（Fe3+）等。金属离子的作用是多方面的：参与酶的活性中心；在酶蛋白与底物之间起桥梁作用；维持酶分子发挥催化作用所必需的构象；中和阴离子，降低反应中的静电斥力。2.辅酶与辅基辅酶与辅基是一些化学稳定的小分子有机物，是维生素样的物质，参与酶的催化过程，在反应中传递电子、质子或一些基团。辅酶与酶蛋白的结合疏松，可以用透析或超滤方法除去；辅基则与酶蛋白结合紧密，不能用上述方法除去。一种酶蛋白只能与一种辅助因子结合成一种特异的酶，但一种辅

44、助因子可以与不同的酶蛋白结合构成多种特异性酶，以催化各种化学反应。维生素（Vitamin）是维持机体正常生命活动所必需的一类小分子有机物，基本不能在体内合成，即使有几种能自行合成，也因合成量不足而必须从食物中摄取。维生素的需要量及缺乏症是营养学的课题。维生素原意是“生命中必不可少的胺”，波兰学者凡克把从米糠中提取出治疗脚气病有效的成分命名为维生素，现已发现13种，按溶解性分为水溶性和脂溶性两大类。脂溶性维生素以独立发挥作用为主，A、D、E、K具有一些特殊的生理功能。以下8种水溶性的维生素都以辅酶的形式参与结合酶的组成。也有些本身就是辅酶，如硫辛酸、抗坏血酸。含维生素的辅酶及其主要功能维生素 辅

45、酶形式 反应类型 硫胺素（B1） 焦磷酸硫胺素（TPP） -酮酸氧化脱羧反应 核黄素（B2） 黄素单核苷酸（FMN）黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD） 氧化还原反应 烟酸或烟酰胺（PP） 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+） 氧化还原反应 泛酸 辅酶A（CoA-SH） 酰基转移反应 吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺（B6） 磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺 转氨基作用、脱羧作用 生物素 生物胞素 CO2的固定 叶酸 四氢叶酸 一碳单位转移 钴胺素（B12） 5- 脱氧腺苷钴胺素甲钴胺素 1，2 -氢原子转移甲基转移 二、酶的活性部位酶的活性部位（active site）是它结合底物和将

46、底物转化为产物的区域，又称活性中心。它是由在线性多肽链中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维小区（为裂缝或为凹陷）。酶活性部位的基团属必需基团，有二种：一是结合基团，其作用是与底物结合，生成酶-底物复合物；二是催化基团，其作用是影响底物分子中某些化学键的稳定性，催化底物发生化学反应并促进底物转变成产物，也有的必需基团同时有这两种功能。还有一些化学基团位于酶的活性中心以外的部位，为维持酶活性中心的构象所必需，称为酶活性中心以外的必需基团。构成酶活性中心的常见基团有组氨酸的咪唑基、丝氨酸的羟基、半胱氨酸的巯基等。如丝氨酸蛋白酶家族的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶，都催化蛋白质的肽键使之水解，但底

47、物的专一性由它们的底物-结合部位中氨基酸基团的性质所决定，与其作用的底物互补。像胰蛋白酶，在它的底物-结合部位有带负电荷的Asp残基，可与底物侧链上带正电荷的Lys和Arg相互作用，切断其羧基侧；胰凝乳蛋白酶在它的底物-结合部位有带小侧链的氨基酸残基，如Gly和Ser，使底物庞大的芳香的和疏水氨基酸残基得以进入，切断其羧基側；弹性蛋白酶有相对大的Val和Thr不带电荷的氨基酸側链，凸出在它的底物-结合部位，阻止了除Ala和Gly小側链以外的所有其他氨基酸。三、酶原激活没有活性的酶的前体称为“酶原”，酶原转变成酶的过程称为酶原激活。其实质是酶活性部位形成或暴露的过程。一些与消化作用有关的酶，如胃

48、蛋白酶、胰蛋白酶在最初合成和分泌时，没有催化活性。胃蛋白酶原在H+作用下，自N端切下几个多肽碎片，形成酶催化所需的空间结构，转化为胃蛋白酶。胰蛋白酶原随胰液进入小肠时被肠激酶激活，自N端切除一个6肽，促使酶的构象变化，形成活性中心，转变成有活性的胰蛋白酶。酶原的生物合成和酶原激活一般不在同一组织、细胞或细胞器中进行。酶原的激活具有重要的生理意义，不仅保护细胞本身不受酶的水解破坏，而且保证酶在特定的部位与环境中发挥催化作用。四、同工酶、变构酶、抗体酶（一）同工酶（isozymes）具有不同的分子形式但却催化相同的化学反应的一组酶称为同工酶。1959年发现的第一个同工酶是乳酸脱氢酶（LDH），它在

49、NADH存在下，催化丙酮酸的可逆转化生成乳酸。它是一个寡聚酶，由两种不同类型的亚基组成5种分子形式：H4、H3M、H2M2、HM3、M4，它们的分子结构、理化性质和电泳行为不同，但催化同一反应，因为它们的活性部位在结构上相同或非常相似。M亚基主要存在骨骼肌和肝脏，而H亚基主要在心肌。心肌梗死的情况可通过血液LDH同工酶的类型的检测确定。（二）变构酶(allosteric enzyme)变构酶又称别构酶，是一类调节代谢反应的酶。一般是寡聚酶，酶分子有与底物结合的活性部位和与变构剂非共价结合的调节部位，具有变构效应。引起变构效应的物质称为变构效应剂。降低酶活性的称变构抑制剂或负效应物；反之，称为变

50、构激活剂或正效应物。变构酶与血红蛋白一样，存在着协同效应。变构酶催化的反应速度与底物浓度的关系常呈S形曲线，这和非调节酶的动力学曲线双曲线不同。变构酶多为限速酶。在多酶体系，限速酶一般位于代谢途径的起点或分支点上，对控制反应总速度起关键作用。如异柠檬酸脱氢酶就是一个变构酶，是三羧酸循环的关键酶，NAD+、ADP和柠檬酸是该酶的变构激活剂，而NADH和ATP是变构抑制剂。（三）抗体酶（abzyme）既是抗体又具有催化功能的蛋白质称为“抗体酶或催化性抗体”，其本质是免疫球蛋白，但是在易变区赋予了酶的属性。1986年科学家根据过渡态理论和免疫学原理，运用单克隆抗体技术成功地制备了具有酶活性的抗体。这

51、加深了人们对酶作用原理的理解，而且在临床医学及制药业等方面有很好的应用。第三节 酶的作用机制一、酶的催化本质现代化学反应速度理论是过渡态理论。在一个化学反应体系中，反应物从“初态” 到“过渡态”，转变成产物即到达“终态”。“过渡态”是底物分子被激活的不稳定态，不同于反应中间物，它具有最高能量，又处在一个短暂的分子瞬间，某些化学键正在断裂和形成并达到能生成产物或再返回生成反应物的程度。酶催化的反应速度快是降低反应的能垒，即降低底物分子所必须具有的活化能。催化和非催化反应，其反应物和产物间总的标准自由能差是一样的。二、中间产物学说和诱导契合学说酶的作用机制包含酶如何同底物结合以及怎样加快反应速度两

52、个内容。20世纪初和40年代，科学家就提出了酶-底物复合物的形成和过渡态概念，即E+S ES E+P。酶和底物形成中间产物的学说已为实验所证实，且分离到若干种ES结晶。已有两种模型解释酶如何结合它的底物。1894年Fischer提出锁和钥匙模型，底物的形状和酶的活性部位彼此相适合，这是一种刚性的和固定的组合。1958年Koshland提出诱导契合模型，底物的结合在酶的活性部位诱导出构象变化；酶也可使底物变形，迫使其构象近似于它的过渡态。这种作用是相互诱导、相互变形、相互适应的柔性过程。酶的诱导契合三、影响酶催化效率的因素酶促反应高效率的原因常常是多种催化机制的综合应用，除酶-底物结合的诱导契合

53、假说外，还有：（一）邻近效应与定向排列在两个以上底物参与的反应中，由于酶的作用，底物被聚集到酶分子表面，彼此相互靠近并形成正确的定向关系，大大提高了底物的局部浓度，底物被催化的部位定向地对准酶的活性中心，实际上是将分子间的反应变成类似于分子内的反应，从而大大提高催化效率。（二） 多元催化酶分子中含有多种不同功能基团，如氨基、羧基、巯基、酚羟基、咪唑基等。既可作质子供体，又可作质子受体，使同一酶分子常可起广义酸催化和碱催化；即可起亲核催化，又可起亲电子催化。这些因素并不是在所有的酶中同时都一样的起作用，对不同的酶起主要作用的因素不完全相同。第四节 酶促反应动力学酶促反应动力学是研究酶促反应的速率

54、和影响此速率的各种因素的科学。一、酶反应速度的测量反应的速率也称速度（velocity），是以单位时间内反应物或生成物浓度的改变来表示。测定酶反应速度时，一般要求非常高的底物浓度以使实验测定的起始反应速率与酶浓度成正比。以产物的生成量对时间作图，绘制反应过程曲线，不同时间的反应速度就是时间为不同值时曲线的斜率。通常采用反应的初速度Vo，即以零时点为起点作一与曲线的线性部分相切的直线，这一直线的斜率即等于Vo，这可以避免底物浓度因被消耗而相对降低以及反应物堆积等因素对反应速度的抑制作用。（产物出现的速率或底物消失速率可根据特殊波长下吸收光的变化用分光光度计测定。）二、酶浓度对反应速度的影响当研究

55、某一因素对酶促反应速度的影响时，体系中的其他因素保持不变，而只变动所要研究的因素。当底物浓度远大于酶浓度时，酶促反应速度与酶浓度的变化成正比。 三、底物浓度对酶反应速度的影响 （一）米-曼氏方程式1913年，Michaelis和Menten根据中间产物学说进行数学推导，得出V与S的数学方程式，即米-曼氏方程式。1925年Briggs和Haldane提出稳态理论，对米氏方程做了一项重要的修正。底物浓度对酶促反应速度的影响呈双曲线。当底物浓度较低时，V与S呈正比关系（一级反应）；随着S的增高，V的增加逐步减慢（混合级反应）；增到一定程度，V不再增加而是趋于稳定（零级反应）。当S Km 时，v =

56、Vmax S /Km，反应速度与底物浓度成正比；当S Km 时 ，vVmax，反应速度达到最大速度，再增加S也不影响V。（二）Km的意义1当V/v =2时, Km =S , Km是反应速率v等于最大速率V一半时的底物浓度，单位为摩尔/升（mol/L）。2Km =K2+K3/K1，当K2 K3时，Km值可用来表示酶对底物的亲和力。Km值越小，酶与底物的亲和力越大；反之，则越小。3Km是酶的特征性常数，它只与酶的结构和酶所催化的底物有关，与酶浓度无关。Km和Vmax可用图解法根据实验数据测出。通过测定在不同底物浓度下的Vo，再用1/Vo对1/S的双倒数作图，又称Lineweaver-BurK作图法，即取米氏方程式倒数形式。四、pH对反应速度的影响 每一种酶只能在一定限度的pH范围内才表现活力，酶表现最大活力时的pH称为酶的最适pH。最适pH的微小偏离可使酶活性部位的基团离子化发生变化而降低酶的活性，较大偏离时，维护酶三维结构的许多非共价键受到干扰，导致酶蛋白的变性。酶的最适pH不是固定的常数，受酶的纯度、底物的种类和浓度、缓冲液的种类和浓度等的影响。一般酶的最适pH在48之间，植物和微生物体内的酶最适pH多在4.56.5,而