酶的非水相催化人们以往普遍认为只有在水溶液中酶才具有

1、第六章 酶的非水相催化人们以往普遍认为只有在水溶液中酶才具有催化活性。酶在非水相介质中催化反响的研究：在理论上进行了非水介质(包括有机溶剂介质，超 临界流体介质，气相介质，离子液介质等)中酶的结构与功能、非水介质中酶的作用机制， 非 水介质 中酶催 化作用动 力学等 方面的 研究，初 步建立 起非水 酶学( non-aqueous enzymology )的理论体系。非水介质中酶催化作用的应用研究，取得显著成果。1. 酶非水相催化的研究概况 酶在非水介质中进行的催化作用称为酶的非水相催化。1.1 有机介质中的酶催化：有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反响。适用于底物、

2、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。 酶在有机介质中由于能够根本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发 挥其催化功能。酶在有机介质中起催化作用时，酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择 性和热稳定性等都有所改变。1.2 气相介质中的酶催化：气相介质中的酶催化是指酶在气相介质中进行的催化反响。 适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反响。由于气体介质的密度低，扩散容易，所以酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化 作用有明显的不同特点。1.3 超临界流体介质中的酶催化：超临界介质中的酶催化是指酶在超临界流体中进行的催化反响。用于酶催化反响的超临界流体应当对酶的结

3、构没有破坏作用，对催化作用没有明显的不良影响； 具有良好的化学稳定性， 对设备没有腐蚀性； 超临界温度不能太高或太低， 最好 在室温附近或在酶催化的最适温度附近； 超临界压力不能太高， 可节约压缩动力费用； 超临 界流体要容易获得，价格要廉价等。1.4 离子液介质中的酶催化： 离子液介质中的酶催化是指酶在离子液中进行的催化作用。离子液( ionic liquids )是由有机阳离子与有机(无机)阴离子构成的在室温条件下呈 液态的低熔点盐类， 挥发性低、 稳定性好。 酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区 域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。在酶的非水相催化中，研究最多的非水介质是有机

4、溶剂。酯酶、脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等水解酶，过氧化氢酶、过氧化物酶、醇脱氢 酶、胆固醇氧化酶、 多酚氧化酶、 细胞色素氧化酶等氧化复原酶以及醛缩酶等转移酶中的十 几种酶都可以在适当的有机溶剂介质中起催化作用。 而且酶在有机介质中的热稳定性比水溶 液中显著提高。在理论上进行了非水介质(包括有机溶剂介质，超临界流体介质，气相介质，离子液介质 等)中酶的结构与功能、 非水介质中酶的作用机制， 非水介质中酶催化作用动力学等方面的 研究，初步建立起非水酶学( non-aqueous enzymology )的理论体系。并进行了非水介质中，特别是在有机介质中酶催化作用的应用研究，利用酶在有机介质

5、中 的催化作用进行多肽、酯类等的生产，甾体转化， 功能高分子的合成， 手性药物的拆分等方 面均取得显著成果。2. 有机介质中水和有机溶剂对酶催化反响的影响2.1 有机介质反响体系：常见的有机介质反响体系包括：(1) 微水介质( microaqueous media )体系 :微水介质体系是由有机溶剂和微量的水组成的反响体系，是在有机介质酶催化中广泛 应用的一种反响体系。微量的水主要是酶分子的结合水，它对维持酶分子的空间构象和催化活性至关重要。 另外有一局部水分配在有机溶剂中。通常所说的有机介质反响体系主要是指微水介质体系。(2) 与水溶性有机溶剂组成的均一体系：这种均一体系是由水和极性较大的有

6、机溶剂互相混溶组成的反响体系。酶和底物都是以溶解状态存在于均一体系中。 由于极性大的有机溶剂对一般酶的催化 活性影响较大，所以能在该反响体系的进行催化反响的酶较少。(3) 与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系：这种体系是由水和疏水性较强的有机溶剂组成的两相或多相反响体系。 游离酶、 亲水 性底物或产物溶解于水相，疏水性底物或产物溶解于有机溶剂相。如果采用固定化酶，那么以悬浮形式存在两相的界面。催化反响通常在两相的界面进行。 一般适用于底物和产物两者或其中一种是属于疏水 化合物的催化反响。(4) (正)胶束体系：胶束又称为正胶束或正胶团，是在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂， 参加外

7、表活性剂后形成的水包油的微小液滴。外表活性剂的极性端朝外，非极性端朝内，有机溶剂包在液滴内部。反响时，酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的底物或产物在胶束内部。反响在胶束的两相界面中进行。(5) 反胶束体系：反胶束又称为反胶团，是指在大量与水不相混溶的有机溶剂中，含有少量的水溶液， 参加外表活性剂后形成的油包水的微小液滴。外表活性剂的极性端朝内，非极性端朝外，水溶液包在胶束内部。反响时，酶分子在反胶束内部的水溶液中，疏水性底物或产物在反胶束外部，催化反 应在两相的界面中进行。2.2 水对有机介质中酶催化的影响：(1) 水对酶分子空间构象的影响：酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。维持酶分

8、子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水( essential water )。必需水与酶分子的结构和性质有密切关系。 不同的酶， 所要求的必需水的量差异很大。(2) 水对酶催化反响速度的影响：有机介质中水的含量对酶催化反响速度有显著影响。在催化反响速度到达最大时的水含量称为最适水含量。在实际应用时应当根据实际情况，通过实验确定最适水含量。(3) 水活度：在有机介质中含有的水，主要有两类，一类是与酶分子紧密结合的结合水，另一类是 溶解在有机溶剂中的游离水。研究说明，在有机介质体系中，酶的催化活性随着结合水量的增加而提高。水活度( water activity, Aw )是指体系中水的逸度(

9、fugacity )与纯水逸度之比。通常可以用体系中水的蒸汽压与相同条件下纯水的蒸汽压之比表示。即：Aw = P/P 0式中， P 为在一定条件下体系中水的蒸汽压，Po 为在相同条件下纯水的蒸汽压 研究说明，在一般情况下，最适水含量随着溶剂极性的增加而增加。而最正确水活度与溶剂的极性大小没有关系。所以采用水活度作为参数来研究有机介 质中水对酶催化作用的影响更为确切。2.3 有机溶剂对有机介质中酶催化的影响： 常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷 等。(1) 有机溶剂对酶结构与功能的影响：酶具有完整的空间结构和活性中心才能发挥其催化功能。在有机溶剂中，酶分子

10、(经过修饰后可溶于有机溶剂者除外)不能直接溶解，而是悬 浮在溶剂中进行催化反响。有些酶在有机溶剂的作用下，其空间结构会受到某些破坏，从而使酶的催化活性受到 影响甚至引起酶的变性失活。(2) 有机溶剂对酶分子外表结构的影响：酶在有机介质中与有机容剂接触，酶分子的外表结构将有所变化。(3) 有机溶剂对酶活性中心结合位点的影响：当酶悬浮于有机溶剂中，有一局部溶剂能渗入到酶分子的活性中心，与底物竞争活性 中心的结合位点，降低底物结合能力，从而影响酶的催化活性。有机溶剂分子进入酶的活性中心，会降低活性中心的极性，可能降低酶与底物的结合 能力。(4) 有机溶剂对酶活性的影响：有些有机溶剂，特别是极性较强的

11、有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的结合 水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性,甚至引起酶的变性失活。有机溶剂极性的强弱可以用极性系数 igP表示。P是指溶剂在正辛烷与水两相中的分 配系数。极性系数越大，说明其极性越小；反之极性系数越小，那么极性越强。研究说明， 有机溶剂的极性越强， 越容易夺取酶分子结合水， 对酶活力的影响就越大。 极性系数 ig P< 2 的极性溶剂一般不适宜作为有机介质酶催化的溶剂使用。(5) 有机溶剂对底物和产物分配的影响： 有机溶剂与水之间的极性不同，在反响过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶 的催化反响。有机容剂能改变酶分子必需水层中底物

12、和产物的浓度。一般选用2 <lg P令 的有机溶剂作为有机介质为宜。3. 酶在有机介质中的催化特性3.1 底物专一性：在有机介质中， 由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化， 致使酶的底物特异性会发生改变。不同的有机溶剂具有不同的极性，所以在不同的有机介质中，酶的底物专一性也不一样。在极性较强的有机溶剂中， 疏水性较强的底物容易反响； 而在极性较弱的有机溶剂中， 疏水性较弱的底物容易反响 。3.2 对映体选择性：酶的对映体选择性(enantioselectivity )又称为立体选择性或立体异构专一性，是酶在对 称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标。酶立

13、体选择性的强弱可以用立体选择系数(Kld )的大小来衡量。立体选择系数越大，表明酶催化的对映体选择性越强。立体选择系数与酶对L-型和D-型两种异构体的酶转换数(Kcat)和米氏常数(Km)有关。 即：(Kcat /K n) LK LD =(Kcat/Kn)D式中，Kld :立体选择系数L:L-型异构体D:D-型异构体Km：米氏常数。即酶催化反响速度到达最大反响速度一半时的底物浓度。Kcat：酶的转换数。是酶催化效率的一个指标。指每个酶分子每分钟催化底物转化 的分子数。酶在有机介质中催化，与在水溶液中催化比拟，由于介质的特性发生改变，而引起酶的对映体选择性也发生改变。酶在水溶液中催化的立体选择性

14、较强，而在疏水性强的有机介质中，酶的立体选择性较差。3.3区域选择性：酶在有机介质中进行催化时，具有区域选择性(regioselectivity ),即酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反响。酶区域选择性的强弱可以用区域选择系数Krs的大小来衡量。区域选择系数与立体选择系数相似，只是以底物分子的区域位置1 , 2，代替异构体的构型 L,D。即：Ki , 2 =(Kcat/Km)1 /(Kcat/Km)23.4键选择性：酶在有机介质中进行催化的另一个显著特点是具有化学键选择性。键选择性与酶的来源和有机介质的种类有关。3.5热稳定性：许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的热稳定性更好。

15、酶在有机介质中的热稳定性还与介质中的水含量有关。通常情况下，随着介质中水含 量的增加，其热稳定性降低。在有机介质中，酶的热稳定性之所以增强，可能是由于有机介质中缺少引起酶分子变性 失活的水分子所致。某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性如表7-1所示。表7-1某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性酶介质条件热稳定性猪胰脂肪酶三丁酸甘油酯T1/2 < 26 h水，pH7.0T1/2 < 2 min酵母脂肪酶三丁酸甘油酯/庚醇T1/2 =1.5 h水，pH7.0T1/2 < 2 min脂蛋白脂肪酶甲苯，90 C, 400 h活力剩余40 %胰凝乳蛋白酶正辛烷，100 CT1/2 =

16、80 min水，pH 8.0, 55 CT1/2 = 15 min枯草杆菌蛋白酶正辛烷，110 CT1/2 = 80 min核糖核酸酶壬烷，110 C, 6 h活力剩余95 %水，pH 8.0, 90 CT1/2 < 10 min酸性磷酸酶正十六烷，80 CT1/2 = 8 min水，70 CT1/2 = 1 min腺苷三磷酸酶甲苯，70 CT1/2 > 24 h(F i -ATPase)水，60 CT1/2 < 10 min限制性核酸内切酶正庚烷，55 C, 30d活力不降彳氐(Hi nd 川)伊匍萄糖苷酶2-丙醇，50 C, 30 h活力剩余80 %溶菌酶环己烷，110

17、CT1/2 =140 min水T1/2 = 10 min酪氨酸酶氯仿，50 CT1/2 =90 min水，50 CT1/2 =10 min醇脱氢酶正庚烷，55 CT1/2 > 50 d细胞色素氧化酶甲苯，0.3 %水T1/2 =4.0 h甲苯，1.3 %水T1/2 =1.7 min3.6 pH值特性：在有机介质反响中，酶所处的 pH环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液pH值相同。这种现象称之为pH印记(pH-imprinting )或称为pH记忆。酶在有机介质中催化反响的最适 pH值通常与酶在水溶液中反响的最适pH值接近或者相同。利用酶的这种pH印记特性，可以通过控制缓冲液中p

18、H值的方法，到达控制有机介质中酶催化反响的最适 pH值。4. 有机介质中酶催化反响的条件及其控制酶在有机介质中可以催化多种反响，主要包括：合成反响、转移反响、醇解反响、氨解反 应、异构反响、氧化复原反响、裂合反响等。酶在有机介质中的各种催化反响受到各种因素的影响：酶的种类和浓度、底物的种类和浓 度、有机溶剂的种类，水含量、温度、 pH 和离子强度等。4.1 有机介质中酶催化反响的类型：(1) 合成反响： 脂肪酶或酯酶在有机介质中可以催化有机酸和醇进行酯类的合成反响： 蛋白酶可以在有机介质中催化氨基酸进行合成反响，生成各种多肽。(2) 转移反响：(3) 醇解反响：(4) 氨解反响 :(5) 异构

19、反响：(6) 氧化复原反响：(7) 裂合反响：4.2 酶的选择 ：不同的酶具有不同的结构和特性，同一种酶，由于来源的不同和处理方法(如纯度、 冻干条件、固定化载体和固定化方法、修饰方法和修饰剂等)的不同，其特性也有所差异， 所以要根据需要通过试验进行选择。在酶催化反响时， 通常酶所作用的底物浓度远远高于酶浓度， 所以酶催化反响速度随 着酶浓度的升高而升高，两者成正比。在有机介质中进行催化反响，对酶的选择不但要看催化反响的速度的大小，还要特别注意酶的稳定性、底物专一性、对映体选择性、区域选择性、键选择性等。4.3 底物的选择和浓度控制：御于酶在有机介质中的底物专一性与在水溶液中的专一性有些差异，

20、所以要根据酶在所使用的有机介质中的专一性选择适宜的底物。底物的浓度对酶催化反响速度有显著影响，一般说来，在底物浓度较低的情况下，酶催化反响速度随底物浓度的升高而增大。 当底物到达一定浓度以后， 再增加底物浓度， 反响 速度的增大幅度逐渐减少，最后趋于平衡，逐步接近最大反响速度。4.4 有机溶剂的选择：有机溶剂是影响酶在有机介质中催化的关键因素之一，在使用过程中要根据具体情况进行选择。有机溶剂的极性选择要适当，极性过强lgP < 2的溶剂，会夺取较多的酶分子表面结合水， 影响酶分子的结构， 并使疏水性底物的溶解度降低，从而降低酶反响速度， 在一 般情况下不选用；极性过弱igP > 5

21、的溶剂，虽然对酶分子必需水的夺取较少，疏水性底物在有机 溶剂中的溶解度也较高，但是底物难于进入酶分子的必须水层，催化反响速度也不高。通常选用2 < igP < 5的溶剂作为催化反响介质。4.5 水含量的控制：有机介质中，水的含量对酶分子的空间构象和酶催化反响速度有显著影响。 要通过试验确定反响体系的最适水含量。最适水含量与溶剂的极性有关，通常随溶剂极性的增大，最适水含量也增大；而到达 最大反响速度的水活度却变化不大，都在0.50.6之间。在实际应用时应当控制反响体系的水活度在0.50.6的范围内。4.6温度控制:温度是影响酶催化作用的主要因素之一。在最适温度下酶催化的反响速度到达最

22、大，这个温度称为。在微水有机介质中，由于水含量低，酶的热稳定性增强，所以其最适温度高于在水溶液中催化的最适温度。要注意的是酶与其它非酶催化剂一样，温度升高时，其立体选择性降低。4.7 pH值的控制：酶在有机介质中催化的最适 pH值通常与在水溶液中催化的最适pH值相同或者接近。在有机介质中，酶的催化活性与酶在缓冲溶液中的pH值和离子强度有密切关系。酶分子从缓冲溶液转到有机介质后，酶分子保存了原有的pH印记。通过调节缓冲溶液pH和离子强度的方法对有机介质中酶催化的pH值和离子强度进行调节控制。5. 酶非水相催化的应用酶在有机介质中的催化如见表7-2。表7-2 酶非水相催化的应用酶催化反响应用脂肪酶肽合成青霉素G前体肽合成酯合成醇与有机酸合成酯类转酯各种酯类生产聚合二酯的选择性聚合酰基化甘醇的酰基化蛋白酶肽合成合成多肽酰基化糖类酰基化羟基化酶氧化甾体转化过氧化物酶聚合酚类、胺类化合物的聚合多