苦马豆素的抑螨作用

1、四川农业大学本科毕业论文苦马豆素对兔疥螨的体外杀灭活性学生姓名：张旺 专 业：动物医学 年 级：2010届 指导教师：胡延春副教授2009年12月苦马豆素对兔疥螨的体外杀灭活性动物医学院 动物医学专业2010届 张旺（指导教师：胡延春 副教授）摘要：从感染疥螨的兔子脚趾上采集痂皮，从中挑取螨虫置于平板玻璃凹槽内，再分别加入不同浓度的苦马豆素溶液，盖上玻片，防止水分蒸发，同时用伊维菌素、阿维菌素做阳性对照，蒸馏水做阴性对照。观察记录不同时间段螨虫的死亡情况。以死亡率、半数致死时间（LT50）、半数致死浓度（LC50）为指标评价苦马豆素的体外杀螨活性。结果显示，50mg/L苦马豆素杀死全部螨虫时间

2、为2d，同浓度伊维菌素、阿维菌素杀螨时间分别为160min、180min；300、100、33mg/L苦马豆素对兔疥螨的LT50分别为19.5h、22h、25h；苦马豆素的LC50=6.818mg/L。结果表明，苦马豆素的体外杀螨活性的性价比显著弱于伊维菌素和阿维素。关键词：苦马豆素；疥螨；杀螨活性；体外Acaricidal activity of swainsonine against sarcoptesscabiei in vitroZhang Wang Department of Veterinary Medicine Major of Veterinary Medicine Colle

3、ge（Tutor:HU Yan-chun Associate professor）Abstract：The crust was collected from the toe of the infected rabbit.Sarcoptes scabiei which was picked from the infected toe were placed into the groove of the glassplate,and then added the different concentrations of swainsonine solution,covering the covers

4、lip,to prevent from the water evaporation,Ivermectin and avermectin were used as positive control,distilled water were used as negative control.The number of dead mites was recorded at different time periods.The mortality,the median lethal time (LT50) and the median lethal concentration were used to

5、 evaluation the acaricidal activity of the swainsonine against sarcoptes scabiei in vitro.The time of the 50mg/L of swainsonine against sarcoptes scabiei was 2d.The same concentration of ivermectin and avermectin were 160min and 180min.The LT50 of the 300,100,33mg/L swainsonine were 19.5h,22h,25h.Th

6、e LC50 of the swainsonine was 6.818mg/L.These results demonstrated that the swainsonine had bad effect against sarcoptes scabiei in vitro.Key words：swainsonine；sarcoptes scabiei；acaricide activity；in vitro苦马豆素广泛存在于各种有毒棘豆和几种黄芪中，棘豆(Oxytropis)隶属豆科蝶形花亚科，多为草本、半灌木或矮灌木，多年生。棘豆广泛分布于我国西北、华北、西南牧区，尤其以青海、陕西、甘肃等省

7、区危害最重，属于我国“三大灾害毒草”之一。在北美与黄芪(Astragalus)被合称为疯草1。苦马豆素属于植物次生代谢化物(plantsecondary compounds，PSC)，研究发现棘豆内生菌能合成苦马豆素2-4，苦马豆素被命名为吲哚里兹啶三醇，分子式为C8H15NO3，相对分子质量为173，熔点1441455。棘豆蔓延速度极快，与可食牧草激烈争夺养份，导致草场的退化6-7，同时家畜在误食含有苦马豆素的多种棘豆时易引起家畜中毒，并表现出明显的临床症状，被称之为疯草病(1ocoism)。其症状有头颈部肌肉震颤、共济失调、感觉过敏等神经系统症状8-9。虽然含有苦马豆素的棘豆被动物食用后会

8、产生各种中毒症状，但是在传统藏医药中，棘豆属植物确具有很多的药用价值，如小花棘豆和急弯棘豆全草药用，具有镇静、麻醉、止痛、利尿、消炎功能；黄花棘豆与甘肃棘豆药用全草，具有利尿逐水、解毒止血，治疗水肿、腹水、疮毒、出血10等药用功效。这些药用功效与其生物碱成分苦马豆素是否相关还未见报道。在现代医学中，发现苦马豆素具有直接杀伤肿瘤细胞的能力，同时具有抗辐射以及缓解肿瘤化疗和放疗时出现的骨髓抑制作用等作用11-17。兔疥螨病是兔疥螨寄生于皮肤表皮内所引起的一种体外寄生虫病，具有季节性高发、高度接触性和传染性的寄生虫病，是造成养兔业巨大经济损失的原因之一。临床上用于防治疥螨病的药物很多，如螨净、双甲脒

9、、阿维菌素、伊维菌素等，但许多药物长期或过多使用后可造成动物中毒或使螨虫产生抗药性18-19。本实验利用苦马豆素对畜禽的毒害作用，采用离体浸杀的方式测定苦马豆素对兔疥螨的杀灭活性强弱，为无依赖性的杀螨新药开发及疯草的科学防除与利用提供参考依据。1 材料与方法1.1 实验材料苦马豆素（西北农林科技大学分子毒理实验室赠送，纯度为99%）、伊维菌素（伊力加）由北京中农华威制药有限公司生产、阿维菌素（阿虫净）由四川泰信动物药业有限公司生产。恒温磁力搅拌器（上海沪西分析仪器厂）、电子天平（赛多利斯有限公司）、移液枪（德国艾本德股份公司）、显微镜（奥林巴斯有限公司）、平板玻璃凹槽、锥形瓶、镊子1.2 实验

10、时间与地点本实验于2009年8月在四川农业大学国家级动物类实验教学中心进行。1.3 实验方法与设计1.3.1 螨虫严重感染疥螨病的家兔由四川农业大学农场的兔场提供。从兔子身上严重感染的脚趾部位收集痂皮置于玻璃凹槽中，在35恒温箱中放置1h，等疥螨爬出，在显微镜下将痂皮挑出，留下疥螨20。备用螨虫在6h内使用，控制温度在14左右，湿度控制在60%左右，以减少环境对螨虫存活时间的影响21。1.3.2 杀螨活性测定用电子天平秤取苦马豆素配制溶液，浓度为50mg/L；用移液枪吸取伊维菌素配制50mg/L溶液；配制50mg/L阿维菌素溶液，阿维菌素为片剂，称量后用磁力搅拌器辅助溶解。参考Fichi等22

11、的离体浸杀方式，将试验分为4个组，第组为50mg/L苦马豆素溶液，第和组为阳性对照组，分别为50mg/L伊维菌素溶液和50mg/L阿维菌素溶液，第组为蒸馏水阴性对照组。向留有15只左右螨虫的平板玻璃凹槽(直径1cm)中，加入100uL各溶液，盖上盖玻片防止水分蒸发。开始计时，按时间间隔(开始30min内每10min观察1次，以后每20分钟观察1次，直至全部死亡)在显微镜下观察和记录螨虫死亡情况，每组4个重复。在判定螨虫是否死亡时，以螨虫虫体长时间不动，用针刺激无反应判为死亡。整个试验在(142)的相对恒定温度下进行，减少温度原因所造成的误差。1.3.3 半数致死时间测定（LT50）将苦马豆素用

12、蒸馏水稀释成300mg/L、100mg/L、33mg/L，向留有15只左右疥螨的平板玻璃凹槽中加100uL溶液，盖上盖玻片。各浓度溶液，每个浓度设4个重复。每隔30min用显微镜观察1次，直至所有螨虫死亡，观察记录每个时段的死亡情况。 半数致死浓度的测定（LC50）将苦马豆素用蒸馏水等比逐级稀释成1.171mg/L、1.756mg/L、2.634mg/L、3.951mg/L、5.926mg/L、8.889mg/L、13.333mg/L、20mg/L、30mg/L，以蒸馏水为阴性对照组，共10个组。向留有15只左右螨虫的平板玻璃凹槽中加100uL溶液，盖上盖玻片，每个组重复4次。每隔1个小时用显

13、微镜观察1次，记录各个时段的死亡率，直至36小时。1.3.5 数据分析所有数据用SPSS17.0软件和EXCEL软件进行统计分析，通过t检验进行显著性分析，采用两变量相关分析评价死亡率与时间或浓度之间的关系，应用几率值回归模型求出毒力回归曲线，采用Pearson卡方拟合度检验模型的拟合度，计算出LT50和LC50。2 结果与分析2.1 杀螨活性50mg/L苦马豆素溶液对兔疥螨的体外杀灭活性见表1。从表1中可看出，以蒸馏水为对照，其它组均表现出不同程度的杀螨活性。蒸馏水螨虫出现死亡的时间为1200min，最长存活时间超过6d；50mg/L苦马豆素溶液螨虫开始死亡时间在300min，全部死亡时间为

14、2d；而伊维菌素在15min开始有死亡，在160min则全部死亡；阿维菌素在17min有螨虫死亡，在180min全部死亡。同浓度伊维菌素和阿维菌素杀螨时间显著短于苦马豆素（P0.05）。由此可知，伊维菌素的杀螨活性最强，阿维菌素次之，苦马豆素的杀螨活性显著弱于伊维菌素和阿维菌素，杀螨活性很不显著。表1：苦马豆素溶液对兔疥螨的体外杀灭活性Table.1:The acaricidal activity of swainsonine against sarcoptes scabiei in vitro组别 螨虫总数 开始死亡 全部死亡 时间/min 时间/min50mg/L苦马豆素溶液 60 300

15、30A 2800300A50mg/L伊维菌素溶液 60 152a 16010a50mg/L阿维菌素溶液 60 174B 18015b蒸馏水 60 1200150C 9000600C备注：表中同一列中右上角标有大写字母的数据之间差异极显著（P0.01），同一列中右上角标有小写字母的数据差异显著（P0.97），苦马豆素的毒力与作用时间呈显著正相关。300mg/L苦马豆素的卡方值X2=6.55780.100，测定值符合理论值；100mg/L苦马豆素卡方值X2=3.71190.975，测定值显著符合理论值；33mg/L苦马豆素卡方值X2=4.75890.975，测定值显著符合理论值。三种浓度都不存在不

16、均匀性因素，不必进行校正。运用EXCEL软件求得苦马豆素的毒力回归方程，利用方程计算出不同浓度苦马豆素的LT50。300mg/L苦马豆素的LT50=19.5h，100mg/L苦马豆素的LT50=22h，33mg/L苦马豆素的LT50=25h。图1：兔疥螨在不同浓度苦马豆素溶液中的累积死亡率Fig.1:The cumulative mortality of sarcoptes scabiei exposed toswainsonine at different time表2：苦马豆素溶液对立体兔疥螨毒力（LT50）的几率值回归分析Table.2:Probit regression analysi

17、s of toxicity(LT50) of swainsonineagainst sarcoptes scabiei in vitro浓度 回归方程 半数致死时 卡方值 相关系数mg/L 间h（LT50） X2 R2300 y=1.2051+2.4869x 19.5 6.5578 0.9798100 y=0.7812+2.2447x 22 3.7119 0.988333 y=-2.7077+2.0958x 25 4.7589 0.9892.3 半数致死浓度的测定（LC50）不同浓度苦马豆素溶液对疥螨的半数致死浓度见图2。由图2可知，阴性对照组蒸馏水在36h后的死亡率为25%，30mg/L1.

18、171mg/L浓度的苦马豆素溶液在36h的致死率为74.73%26.35%，当浓度在13.333mg/L以上时死亡率大于50%。利用EXCEL软件求得浓度与死亡率的回归方程为y=5.749x+10.803，相关系数R2=0.9027，查表可得P0.01，表明死亡率与浓度呈一定的相关性。但是时间与死亡率的相关系数大于浓度与死亡率的相关系数，说明时间对疥螨的死亡率影响大于浓度的影响。求得苦马豆素对兔疥螨36h的LC50为6.818mg/L。图2：苦马豆素对兔疥螨的36h死亡率Fig.2:The mortality of different concentrations of Swainsonine

19、 against sarcoptes scabiei after 36h3 结论与讨论从实验结果可得出，苦马豆素对兔疥螨的杀灭活性弱，具有很长的半数致死时间（LT50）和较大的半数致死浓度（LC50）。其杀螨活性对浓度依赖不显著，时间依赖大于浓度依赖。50mg/L苦马豆素溶液杀死全部螨虫的时间长达2d多，远大于同浓度的伊维菌素和阿维菌素的杀螨时间，伊维菌素和阿维菌素的杀螨时间小于3h，具有高效性。苦马豆素对牲畜有较强的毒害作用，试验中对兔疥螨的毒害作用很弱，其可能原因有以下几个方面。第一由于物种的差异，螨虫体内不含有苦马豆素所作用的酶或细胞等物质，苦马豆素的毒害作用在螨虫体内产生不了作用；第二

20、是螨虫在采用离体浸杀方式时，螨虫体表对苦马豆素的吸收很少，体内苦马豆素蓄积量达不到毒杀的含量；第三是螨虫体内有能快速分解代谢苦马豆素的物质；第四是在实验中苦马豆素的浓度不够，从测定半数致死时间的实验可得知杀螨活性对浓度有一定依赖性，若采用高浓度苦马豆素进行实验能提高杀螨活性；苦马豆素杀螨活性弱的具体原因还有待进一步研究。苦马豆素提纯物在市场上价格很高（每毫克1000元以上），在实验中不能用高浓度的苦马豆素做实验，伊维菌素和阿维菌素的价格较低（每毫克5元以下），实验也证明了同浓度下的苦马豆素杀螨活性远小于已开发药物伊维菌素和阿维菌素，且苦马豆素本身就对人畜有毒害作用，综上所述，开发关于苦马豆素的

21、杀螨药物不具有经济上和药效上的优势。实验中伊维菌素和阿维菌素杀螨活性强也同很多研究报道相同。伊维菌素和阿维菌素受浓度和温度等因素影响，杀螨时间有所差异；蒸馏水对螨虫影响不大，在低温高湿环境下最长能存活一周以上，与螨虫的研究结果相符19。伊维菌素和阿维菌素在杀螨效果上很显著，但这两种药物也有其自身的缺点，有研究报道疥螨会对伊维菌素和阿维菌素产生抗性，也有报道伊维菌素和阿维菌素的使用会对环境产生不良影响。因此还有待开发出应用更加广谱、高效、安全、环保的杀虫药物。到目前为止，国内还没有关于苦马豆素杀螨活性的研究。苦马豆素在实验中已被证实对兔疥螨的杀灭作用弱，对其它种属的体外寄身虫有无杀灭活性还有待进

22、一步研究。含有苦马豆素的疯草和黄芪在近年来被作为抗肿瘤药物进行了深入研究，此外在藏医药中还有许多独特的药效，因此苦马豆素的生物学活性具有巨大的开发前景。本研究结果对苦马豆素的开发与利用具有一定的指导意义，为以后关于苦马豆素的药物开发提供一定的科学依据。参考文献1 席琳乔，马丽萍.草地毒草棘豆的研究现状及进展J.草原与草坪，2003(3)：19-22.2 McLain-Romero J，Creamer R,Zepeda H,et a1.The toxicosis of Embellisia fungi from locoweed(Oxyt ropis lambertii)is similar t

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