恩诺沙星纳米粒的制备及稳定性研究_图文

1、 安徽农业科学,Journal of Anhui Agri. Sci. 2009,37(5 :2019-2021责任编辑姜丽责任校对张士敏恩诺沙星纳米粒的制备及稳定性研究龚露, 杨先乐3, 胡鲲(上海海洋大学国家水生动植物病原库, 上海201306摘要目的优化恩诺沙星纳米粒制备参数, 考察其稳定性。方法以壳聚糖为辅料, 采用离子交联法和冷冻干燥法制备恩诺沙星壳聚糖纳米粒, 以包封率为参考指标设计正交试验, 确定优化制备参数, 以透射电镜观察其表观特征, 并对其热稳定性及紫外稳定性进行考察。结果以优化参数制备的恩诺沙星壳聚糖纳米粒平均粒径237. 4nm , 平均包封率(71. 9±2

2、. 2 %, 平均载药量(12. 4±0. 6 %。与原料药相比,4h 热降解率和紫外降解率分别减少了38. 4%和13. 3%。结论离子交联法和冷冻干燥法适用于制备恩诺沙星壳聚糖纳米粒, 其产品具有良好的热稳定性和紫外稳定性。关键词恩诺沙星; 壳聚糖; 纳米粒; 热稳定性; 紫外稳定性中图分类号S859文献标识码A 文章编号0517-6611(2009 05-02019-03Study on the P rep aration and the Stability of E nrofloxacin N anop articles (ENR 2NPs(G ONG Lu 2yang et

3、 al S tate C ollection Center of Aquatic Path ogen , Shanghai Ocean University , Shanghai 201306Abstract ObjectiveT he research aim ed to optim ize the preparing m eth od of enrofloxacin nan oparticles (E NR 2NPs and investigate its stability. Meth odE NR 2NPs was prepared using freeze 2drying and i

4、onic gelation m eth od w ith chitosan. T he therm al and ultraviolet stability were m easured at the sam e tim e. Result T he nan oparticles observed by TE M were spherical w ith a m ean particle size of 237. 4nm. T he efficiency and drug loading of E NR 2NPs were (71. 9±2. 2 %and (12. 4±0

5、. 6 %.T he total therm al and degradation of E h were decreased by 38. 4%and 13. 3%com pared to raw E NR. C onclusionI onic gelation and freeze m eth od ia the of E NR 2NPs and its product has characteristic of g ood therm al and ultraviolet stability. K ey w ords Enrofloxacin ; Chitosan ; Nan opart

6、icles ; T herm al stability ; 恩诺沙星(Enrofloxacin ,E NR 第3, 与其。目前, 常用的E NR 剂型单一, 主要以粉剂为主, 存在口服疗效低、毒副作用大等缺点2, 同时由于氟喹诺酮类药物对光、热敏感, 极易因降解而影响药效3-4。开发一种口服疗效好、毒副作用低、稳定性高的E NR 新剂型, 对于E NR 的安全使用和无公害渔业的发展有着积极的意义。目前, 以脂质体、微球和纳米粒等新剂型为代表微型包囊技术已在药物的研究和应用中受到广泛关注。其中, 纳米粒(Chitosan nan opartieles ,NPs 是粒径在11000nm 的新型药物

7、载体, 具有保护囊芯物和提高药物稳定性的作用, 同时还具有靶向、缓释等控释能力, 可提高药物在体内的生物利用度5-6。为此, 笔者以壳聚糖(CS 为囊材, 用离子交联法(I onic gelation 和冷冻干燥法(Freeze 2drying 制备了恩诺沙星100m l 棕色容量瓶中, 制成E NR 母液。以上述母液配制10、20、50、100、150、200g/m l 不同浓度梯度的E NR 标准溶液, 以紫外分光光度计测定274nm 处的吸光度, 并以浓度(g/m l 为横坐标, 以吸光度为纵坐标制作E NR 标准曲线。1. 2. 2E NR 2NPs 的制备及鉴定。1. 2. 2. 1

8、制备。精密称取一定量的E NR , 溶于20m l CS 的1%醋酸溶液, 以NaOH 调节pH 值至5。在室温磁力搅拌下逐滴加入TPP 溶液8m l , 维持搅拌30m in 加以固定, 得E NR 2NPs 混悬液, 分装于冷冻瓶中, -50下抽真空, 冷冻干燥后即得。1. 2. 2. 2包封率和载药量的测定。取E NR 2NPs 样品适量, 以0. 1m ol/L 盐酸溶液溶解后, 以“1. 2. 1”的方法测定溶液中游离的E NR 量; 同时取等量同批次样品, 以0. 1m ol/L 盐酸溶液溶解, 超声破碎30m in ,3倍稀释, 以紫外分光光度计测定样品中E NR 总量, 并按以

9、下公式计算包封率和载药量:包封率(% =(1-游离E NR 量/样品中E NR 总量 ×100纳米粒(E NR 2NPs , 并评价其表观特征、包封率、载药量、热稳定性和紫外稳定性等指标, 旨在为开发高效、低毒、稳定的E NR 新制剂开辟一条新思路。1材料与方法1. 1材料仪器:UNICAN 紫外分光光度计;S A V ANT N ova 2ly phe 2N L150型冷冻干燥机;H itachi H600透射电子显微镜;MI 2CROS ON 超声波破碎仪;S ANY O 烘箱。载药量(% =样品中E NR 总量/样品总质量×1001. 2. 2. 3粒径与形态观察。取

10、适量E NR 2NPs 纳米粒冻干品, 以蒸馏水复溶后取适量悬液滴加于铜网上, 用2%磷钨酸钠负染, 以透射电镜(TE M 观察其形态, 并测定其平均粒径, 测量的纳米粒总个数大于500个7。1. 2. 3E NR 2NPs 稳定性研究。1. 2. 3. 1热稳定性评价。将样品和原料药置于60恒温烘试剂:ENR 原料药, 含量98%, 购于山东新阳光动物药业有限公司; CS , 脱乙酰度>90%; 三聚磷酸钠(TPP , 化学纯 ; 冰乙酸(分析纯 等化学试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。1. 2方法1. 2. 1E NR 标准曲线的制作。精确称取10. 0mg E NR , 加入基金

11、项目国家“十一五”科技支撑计划项目(2006BAD03B04 。作者简介龚露(1982- , 男, 上海人, 硕士研究生, 研究方向:渔药药理学。3通讯作者, 教授,E 2mail :xlyangshfu. edu. cn 。收稿日期2008212201箱中加热处理, 分别于0. 167、0. 500、1. 000、1. 500、2. 000、3. 000、4. 000、8. 000、12. 000h 取适量样品, 溶于蒸馏水后超声波破碎处理30m in , 利用“1. 2. 1”的方法测定E NR 浓度变化,3次重复, 按下式计算热降解率:热降解率(% =(1-采样点样品浓度/样品处理前浓度

12、 ×1001. 2. 3. 2紫外稳定性评价。将样品和原料药置于40W 紫外 2020安徽农业科学2009年灯(垂直距离60cm 下照射, 分别于0. 167、0. 500、1. 000、1. 500、2. 000、3. 000、4. 000、8. 000、12. 000h 取适量样品, 溶于粒径为237. 4nm 。2. 3ENR 2NPs 的稳定性评价2. 3. 1热稳定性评价。由图3可知,E NR 原料药及E NR 2NPs蒸馏水后超声波破碎仪处理30m in , 利用“1. 2. 1”的方法测定E NR 浓度变化,3次重复, 按下式计算紫外降解率:在12h 内均有不同程度的热

13、降解现象。E NR 原料药在4h 内热降解率达到63. 3%, 而E NR 2NPs 降解率仅为24. 9%, 相比原料药减少了38. 4%, 表现出较好的热稳定性。随着原料药样品中E NR 有效成分的减少,E NR 原料药在4h 以后降解速率趋于平缓,12h 热降解率为79. 9%; 而E NR 2NPs 在4h 以后热降解速率没有明显的减缓,12h 热降解率为48. 5%, 这 可能与部分载体材料受热降解而失去保护作用有关。紫外降解率(% =(1-采样点样品浓度/样品处理前浓度 ×1002结果与分析2. 1ENR 标准曲线绘制以274nm 为检测波长, 将不同浓度梯度的吸光度A

14、值与相应浓度C 作一元线性回归(图1 。紫外分光光度法在E NR 浓度10200g/m l 范围内反应灵敏, 数值稳定, 浓度C 与吸光度A 线性关系良好, 其回归方程为:A=0. 0151C +0. 0594(R =0. 9975 。图2ENR 2NPs 透射电镜照片(×400001ENR 溶液标准曲线Fig. 1The stand ard curve o f ENR solutionFig. 2T ransmission electron microscope picture o f ENR 2NPs(×40000 2. 2ENR 2NPs 的优化制备及其鉴定结果2.

15、2. 1优化制备结果。以各试验组E NR 2NPs 包封率为评价参数, 以CS 溶液浓度、TPP 溶液浓度和E NR 用量为3个影响因素, 每个因素选取3个水平进行L 9(33 正交试验确定优化制备工艺。E NR 2NPs 制备条件的L 9(33 正交试验设计如表1所示。由极差分析结果可知:TPP的浓度对药物包封率影响最大,CS 浓度次之,E NR 用量最小。制备E NR 2NPs 的最优化条件为:CS浓度2. 0mg/m l ,TPP 浓度1. 5mg/m l ,E NR 用量为8mg 。以此最佳制备参数制得的E NR 2NPs 冻干品为白色细小薄片, 表面疏松多孔, 复溶性良好, 平均包封

16、率为(71. 9±2. 2 %, 平均载药量(12. 4±0. 6 %。表1L 9(33 正交试验结果T ab le 1The resu lts o f L 9(33 orthogonal test图3ENR 2NPs 和ENR 原料药的热降解率Fig. 3The therm al degrad ation rate o f ENR 2NPs and ENR ra w m a 2terial drugs2. 3. 2紫外稳定性评价。由图4可知,E NR 原料药及E NR 2NPs 在紫外灯照射12h 内均有不同程度的降解现象。E NR编号123456789C S 浓度m g

17、/m l T PP 浓度m g/m l E NR 用量m g 包封率%1. 51. 51. 52. 02. 02. 02. 52. 52. 57. 071. 21. 51. 81. 21. 51. 81. 21. 51. 815. 53443. 162. 446. 752. 967. 652. 942. 054. 658. 9极差R图4ENR 2NPs 和ENR 原料药的紫外降解率2. 2. 2质量评价。以优化条件制备的E NR 2NPs 的透射电镜Fig.4The u ltraviolet degrad ation rate o f ENR 2NPs and ENR ra wm ateria

18、l drugs照如图2所示。由图2可知,E NR 2NPs 在水中重分散后呈球形或类球形, 表面光滑, 分散性良好, 无明显黏连现象, 平均 37卷5期龚露等恩诺沙星纳米粒的制备及稳定性研究2021原料药在4、12h 降解率为分别为20. 1%、45. 9%, 降解速率均匀。E NR 2NPs 在4、12h 降解率分别为6. 8%、9. 5%, 相比原料药减少了13. 3%和36. 4%, 表现出良好的抗紫外性能。4h 前E NR 2NPs 降解速率较快, 可能与部分药物被吸附于载3. 3ENR 2NPs 应用前景纳米粒作为新一代控释剂型的代表, 具有良好的缓、控释能力和靶向能力, 能提高药物

19、口服的生物利用度, 并提高药物稳定性15-16。该研究以离子交联法和冷冻干燥法制备E NR 2NPs 操作简便, 参数可控, 其辅料壳聚糖来源广泛, 生物降解性和生物黏附性良好, 非常适于工业大规模生产, 因此对开发“三效(高效、速效、长效 和三小(剂量小、毒性小、副作用小 ”的无公害水产用药具有积极的意义和良好的发展空间。参考文献1朱模忠. 兽药手册M.北京:化学工业出版社,2002.2邓永强, 汪开毓, 黄小丽. 水产药物制剂生产存在的问题与对策J.科学养鱼,2004(7 :42.3张健, 陈栋牛, 袁誉洪, 等. 喹诺酮类药物的热稳定性及其热分解非等温动力学研究J.药学学报,2000,3

20、5(6 :445-450.4胡昌勤, 谷道昭, 常桂兰, 等. 喹啉羧酸类喹诺酮抗生素的光促反应特性J.药学学报,1999,34(1 :848-853.5林爱华, 平其能. J.药学专论,2006,15(21 :25-27.6NS I , N A A I , parativ uptake studies o fand n on 2intestinal cell lines and T ffect m ucus .Pharm aceuti 2(8 7A , E N P. E ffect o f porosity on the release kinetics o f one 2loaded PE

21、G 2g 2P LA nan oparticles J.Journal o f C ontrolled Re 2lease ,2005,107:203-214.8武华丽, 胡一桥. 冷冻干燥制剂的稳定性研究进展J.中国药学杂志,2001,36(7 :436-438.9李锐, 周友中, 肖希龙. 恩诺沙星肺靶向微球的制备J.中国兽医学报,2008,28(1 :79-83.10饶春意. 氟罗沙星溶液光降解反应机理的探讨J.中国药品标准,2003,4(6 :39-41.11白政忠, 张秋生, 盛龙生. 喹诺酮类抗菌药光降解及光降解产物研究进展J.中国药事,2000,14(5 :322-325.12莫

22、毅, 贺英菊, 闫根全, 等. 药物对光稳定性研究进展J.中南药学,2006,4(3 :221-224.13潘卫三. 新药制剂技术M.北京:化学工业出版社,2004:116-127. 14王会娟, 李馨儒, 哀泉, 等. 番茄红素微囊的制备及稳定性考察J.中国新药杂志,2004,13(5 :411-413.15缪勇. 药物制剂研究开发与生产新工艺技术应用大全M.北京:当代中国音像出版社,2004:1045.16张俊山, 陈晓青, 蒋新宇, 等. 纳米药物研究进展J.中国现代医学杂志,2002,12(14 :39-40.体表面无法受到保护而产生降解有关。3结论与讨论3. 1冷冻干燥法对ENR 2

23、NPs 质量的影响冷冻干燥是利用冷冻的溶液在低温低压条件下, 从冻结状态不经过液态直接升华除去水分完成干燥, 使药物保持原有的理化性质和生理活性, 并提高药物包封率。此外其具有疏松多孔的结构, 含水量低, 因而还可提高药物稳定性8。该研究结果表明, 以CS 浓度2. 0m g/m l ,TPP 浓度1. 5m g/m l ,E NR 用量8m g 为优化条件制备的E NR 2NPs 冷冻干燥后物理性质良好, 形态为白色细小薄片, 表面疏松多孔,TE M 电镜观察颗粒光滑均匀, 平均粒径为237. 4nm , 纳米粒冻干品平均包封率为(71. 9±2. 2 %, 平均载药量(12. 4

24、±0. 6 %。这与文献报道9同类E NR 剂型相比具有更高的包封率和载药量。3. 2ENR 及ENR 2NPs 的稳定性在药物的生产、运输、等环节中, 药物稳定性会因各种因素而下降, , 造成药物疗效降低、失效, -理化性质外, pH 值等有关, , 的活化能, , 导致药物降解12。该研究结果表明,E NR 对环境中热和紫外较敏感, 在热或紫外处理下可被降解, 其降解程度与处理时间呈正相关。药物微囊化及冷冻干燥是提高药物稳定性的主要方法。其中药物微囊化是以辅料包裹药物形成微囊或纳米囊, 以隔绝空气、水分和光线, 使药物稳定性明显提高13-14。该研究结合药物微囊化技术和冷冻干燥技

25、术, 采用离子交联法制备E NR 纳米粒悬液, 并以冷冻干燥法制得冻干粉, 产物在热环境和紫外照射环境下,24h 降解程度低于E NR 原料药, 相比E NR 原料药表现出更佳的抗逆性。(上接第2008页3. 3. 3N D VI 、T M 5/T M 3和T M 4/T M 3合成N D VI =(T M 4-T M 3 /(T M 4+T M 3 。基于上面的比值法, 也有学者提出先计算彩色图像能够更清晰地反映地震前后的差别, 被毁坏的植被和其他地物可以看得更加明显。NDVI 、T M 5/T M 3和T M 4/T M 3的组合能较好地反映土壤信息。因此, 以T M 453的组合出归一化植被指数N D VI 8, 即:ND VI =(T M 4-T M 3 /(T M 4+T M 3 , 之后利用N D VI 、T M 5/T M 3和T M 4/T M 3(分别赋红、绿、蓝为基础, 参考其他组合(如T M 145、T M 472、NDVI 、T M 5/