EGFP在肿瘤细胞中的表达分析

1、 EGFP在肿瘤细胞中的表达分析黄娟西南大学生命科学学院，重庆 400715目录摘 要IAbstractIII第一章 文献综述11.1 HTERT基因在肿瘤治疗中的研究进展11.1.1 HTERT基因的发现11.1.2 HTERT基因的结构和特征11.2 HTERT基因在肿瘤治疗中的生物学意义101.2.1 端粒与端粒酶101.2.2 端粒酶与肿瘤的关系101.2.3 针对端粒酶的抗肿瘤治疗101.3 HTERT基因肿瘤在治疗中的研究进展111.3.1 HTERT基因肿瘤治疗中的发展前景131.3.2 HTERT基因在肿瘤在治疗中的存在的问题131.3.3 HTERT基因在肿瘤治疗中的展望13

2、第二章 引言15第三章 材料与方法173.1 实验材料173.1.1 实验动物173.1.2 主要仪器与设备17主要试剂、培养基和试剂盒183.1.4 常用试剂及其配制193.1.5 常用生物信息学网站和分析软件203.2 实验方法203.2.1 猪基因组DNA的提取213.2.2 总RNA的提取及cDNA的制备213.2.3 EST拼接和引物设计223.2.4 PCR及PCR-RFLP分析223.2.5 PCR产物的纯化、克隆和测序243.2.6 印记分析253.2.7 基因组织表达半定量分析263.2.8 基因定位分析26第四章 结果与分析294.1 基因组DNA的提取294.2 总RNA

3、的提取与cDNA的制备294.2.1 总RNA的提取294.2.2 cDNA的制备与检测304.3 四个候选基因的克隆、印记鉴定与基因定位304.304.3.2 猪GTL2基因344.3.3 猪RTL1基因384.3.4 猪DIO3基因38第五章 讨论385.1 印记基因的分离385.2 印记基因表达的研究方法385.2.1 基于“表达的SNP”的分析方法385.2.2 应用品种间正反交模型分析印记基因的可行性385.3 四个候选印记基因的表达状况385.3.1 DLK1基因385.3.2 GTL2基因385.3.3 RTL1基因385.3.4 DIO3基因385.4 RTL1和DIO3基因的

4、遗传定位385.5 印记基因与动物遗传育种38参考文献38致谢38发表论文及参加课题一览表38摘要：【目的】构建携带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP)质粒载体，通过将启动子置换成端粒酶（HTERT）启动子，使其能在肿瘤细胞中特异性的表达，观察EGFP的表达情况以及对靶细胞生物活性的特异性的影响。【方法】以质粒pEGFP-N3为模板进行PCR反应获得完整保留pEGFP-N3的多克隆酶切位点的EGFP基因片段，定向插入更换启动子的pLenti6V5DTop质粒中，其启动子由原来的PCMV置换为HTERT启动子，筛选出正确的重组绿色荧光蛋白基因的重组载体pLenti6V5DTop-EGFP，在阳离子脂

5、质体的作用下导入肿瘤细胞后，获得具有绿色荧光蛋白颗粒的表达产物，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白作为目的基因在体外的表达情况，以及对肿瘤细胞生物活性的影响。【结果】成功克隆携带有EGFP基因的载体，该载体经导入人的肿瘤细胞后产生稳定的表达产物。关键词：EGFP基因；pLenti6V5DTop质粒载体；HTERT启动子；pLenti6V5DTop-EGFP；导入；人体肿瘤细胞EGFP gene's expression and analysis in cancer cell of human juan huangSchool of Life Science, Southwest China

6、 University, Chongqing 400715, ChinaAbstract:【objective】to construct the plasmid carrying enhanced green fluorescent protein (EGFP)gene and to observe the expression of green fluorescent proteinin in human cancer cells.【methods】【results】【conclusion】Key words:green fluorescent protein (EGFP)gene ;pLe

7、nti6V5DTop plasmid;HTERT promoter;translate;human cancer cells;第一部分 文献综述1.1 HTERT基因在肿瘤治疗中的研究进展1.1.1、HTERT基因的发现1985年Blackburn研究小组首先在四膜虫中发现了催化合成端粒重复序列的端粒酶(Telomerase)5。之后耶鲁大学Morin(1989)在人宫颈癌细胞中也发现了人端粒酶6。端粒酶是一种核糖核蛋白，它由蛋白质和与端粒DNA互补的RNA所组成，它能以自身的RNA为模板合成端粒DNA，本质上属逆转录酶。目前，包括人的多种生物的端粒酶RNA组份及其基因已被克隆79，21，而四

8、膜虫、线虫、酵母、小鼠及人端粒酶的蛋白组份及其基因也已纯化和克隆成功1012。1.1.2、HTERT的结构和特征 在脊椎动物端粒的DNA结构为5(TTAGGG)n-3重复序列，调节蛋白（Telomerase Regulatory Factors,TRF1、TRF2），二者C-末端都有特异性的Myb重复序列同源保守域（telobox），可特异性识别并结合端粒的双链DNA及3端富G的单链尾。中间部分都有长约200核苷酸的同源二聚体化域。所不同的是TRF1的N-末端是酸性基因，而TRF2的N-G末端是碱性基因。野生型TRF1过表达可导致端粒进行性缩短，而突变型（缺失DNA-结合域）TRF1可延长端粒

9、，表明它调节端粒酶依赖的端粒长度。TRF1蛋白结合于端粒重复序列上数量可作为负性的长度依赖性的调节因子。突变（显性失活）TRF2过表达的细胞表现为端粒缩短，结合于双链DNA的TRF2减少，未端单链G尾丢失，引发由P53介导的损伤途径，染色体出现端端融合、有丝分裂的发生率异常升高甚至直接导致细胞凋亡。提示TRF2的作用在于调节端粒的功能。它通过维持端粒功能性单链3-G尾的稳定而直到防止其端端融合而保护染色体及细胞的完整性。然而该模式无法解释为何结合双链DNA上的TRF2蛋白影响到单链G尾的稳定性及何染色体末端单链G尾不被当作DNA损伤问题。Griffith等结合电镜观察提出端粒结构假说D-loo

10、p-T-loop。由于TRF2的存在，DNA双链形成“环状（T-loop）”，而单链G尾的TTAAGGG在环的端口内侧与CCCTAA碱基互补形成100-200碱基对D-loop，由此保护了DNA末端不受损坏，而TRF2蛋白很可能结合于D-loop接口处参与了T-loop-D-loop的形成与稳定。T不结构模式亦直接或间接地参与染色体末端结构稳定性的维持。TRF2对端粒结构的稳定可能提示了端粒酶的其他作用；随着DNA复制，端粒逐渐缩短，TRF2结合位点逐渐减少至消失，端粒失去了TRF2的保护作用。端粒酶通过在端粒末端合成TTAGGG重复片段而提供TRF2结合位点，使TRF2蛋白结合于其上行使防止

11、染色体融合的功能。 近年来肿瘤的端粒-端粒酶假说已被越来越多的实验所证实。85%以上的恶性肿瘤有端粒酶表达，而正常组织(生殖细胞、造血细胞等胚胎性干细胞除外)则呈阴性。端粒酶是迄今发现的一个最为广泛的肿瘤标志，在细胞永生化和肿瘤发生发展过程中起重要作用。自从1995年Feng等研究发现反义人端粒酶基因能抑制HeLa细胞端粒酶活性并导致其死亡以来，针对端粒酶开发新的抗肿瘤药物已成为近年来的新热点。1.2、HTERT在肿瘤治疗中的生物学意义、端粒和端粒酶 早在本世纪三四十年代M%26uuml;ller和McClintock就认识到染色体末端存在一种维持染色体稳定和完整的特殊结构端粒(telomer

12、e)，它能防止染色体DNA降解、末端融合、缺失和非正常重组1，2。但直到20年前，人们才相继辨明了多种物种的端粒结构由58 bp且富含G碱基核苷酸串联重复序列和端粒结构蛋白构成，人和其它脊椎动物的端粒DNA均为(TTAGGG)n3。端粒结构的阐明圆满解决了令人困惑的染色体末端复制难题4。DNA复制时DNA多聚酶必须以RNA为引物，从5端向3端方向复制，复制完成后RNA引物被降解，所留5端空隙由端粒DNA来填补，防止染色体末端DNA在复制过程中的不断丢失，从而维持了染色体结构的完整性。 肿瘤的“端粒-端粒酶”假说： 在对端粒和端粒酶深入研究的基础上，Harley(1991)提出了“端粒-端粒酶假

13、说”13。他认为，端粒可能是细胞有丝分裂的计时钟(mitotic clock)。在细胞有丝分裂过程中，端粒DNA不断丢失而使端粒缩短，当端粒缩短到一定长度时，可能会触发某种信号，使细胞进入前临转点M1期，此时细胞不再分裂，而是退出细胞周期而老化。如果此时细胞被病毒转化、癌基因激活或抑癌基因失活，细胞便可越过M1期继续分裂，端粒继续缩短，最终进入后临转点M2期。多数细胞由于端粒太短而失去功能并死亡，但极少数细胞的端粒酶在此阶段被激活，从而恢复端粒的功能，使细胞逃避死亡而获得永生化。、端粒酶与肿瘤的关系 “端粒-端粒酶”假说认为端粒酶的再激活与细胞永生化和恶性肿瘤的发生发展有密切关系，大量研究已证

14、实了此推断。Kim等14检测了100株人肿瘤细胞系的端粒酶活性，98%呈阳性，而22个正常细胞株端粒酶均为阴性。张桥等15总结了近年来人类肿瘤组织端粒酶活性的测定结果，表明人肿瘤端粒酶活性的阳性率高达84.3%(766/909)，而相应的正常、瘤旁组织及良性肿瘤端粒酶阳性率仅为3.4%(12/352)。Counter等16，17检测了SV40、HPV或AD5转化前后的人胚肾细胞和人上皮 端粒长度和端粒酶活性，结果发现转化后的永生化细胞端粒长度趋于稳定并伴有端粒酶的激活。Bednarek等18进一步研究了化学诱导的鼠皮肤乳头状瘤发生发展过程中端粒酶活性变化，结果发现在10周内11例中只有1例显示

15、高水平的端粒酶活性，而到30周时所有的标本均显示出了高水平的端粒酶活性，表明肿瘤的发生发展与端粒酶活化有密切关系。Hiyama等19，20对乳腺癌、胃癌病人的研究发现，端粒酶阳性者肿瘤体积较大、淋巴结转移率高、预后差。、针对端粒酶的抗肿瘤治疗 由于端粒酶特异性地表达于绝大多数肿瘤细胞，又是肿瘤细胞无限增殖所必需，因此开发针对端粒酶的抗肿瘤药物成为近年来肿瘤治疗学研究的另一热点。正常人血干细胞、生殖细胞和一些淋巴细胞虽有端粒酶活性，但它们的端粒酶活性很低，且有足够长的端粒DNA储备，也就是说抗端粒酶治疗对这些细胞的影响较小，可见抗端粒酶药物具有广谱、高效、低毒的优点，具有很好的临床应用前景。美国

16、的多家生物技术和药物公司已着手开发该类药物。、反义基因 端粒酶RNA组份中含有与端粒DNA序列互补的模板序列，针对该模板序列设计的反义核苷酸可阻断其模板作用从而抑制端粒酶合成端粒序列。Feng等21(1995)首先研究发现反义人端粒酶RNA可抑制肿瘤细胞的端粒酶活性并导致细胞死亡，用反义hTR转染人HeLa细胞，发现端粒DNA逐渐丢失，细胞经2326个倍增周期后开始死亡。Norton等22设计了一组不同长度的与人端粒酶RNA模板区互补的肽核酸(Peptide nucleic acids, PNAs)，研究发现该PNAs能显著抑制永生化的人乳腺上皮细胞系HME50-5的端粒酶活性，抑制作用较单纯

17、的反义核酸强1050倍(PNA5-TAGGGTTAGACAA的IC50为0.9 nmol/L)，而且有严格的序列特异性和剂量依赖关系，并随PNA长度增加而增强。由于PNAs具有高亲合性，高稳定性和选择性强的特点，并易于人工自动固相合成，因此是一种值得开发的抗肿瘤制剂。Mate等23报道与哺乳动物端粒重复序列相同的六聚硫代磷酸酯寡核苷酸(Hexameric phosphorothioate oligonucleotide, PS-ODN)可阻 断端粒酶RNA的模板作用或作为端粒酶的底物而竞争抑制端粒酶的活性，使Burkitt淋巴瘤细胞体外生长受抑并出现凋亡。在Burkitt淋巴瘤裸鼠皮下移植模型

18、中，经渗透泵原位每天给予50 g的PS-ODN具有明显的治疗作用。可见针对端粒酶RNA的反义基因能有效抑制其活性，目前人端粒酶蛋白的结构和功能已基本阐明，用反义基因抑制其功能能否阻断端粒酶的活性值得进一步尝试。 1.2.3.2、核酶 核酶(ribozyme, RZ)是一类具有酶活性的RNA分子，可特异性地与靶RNA结合并对其进行切割，使其失去生物学功能。Kanazawa等24设计了一种直接作用于端粒酶RNA组分的锤头状核酶(teloRZ)，观察其对端粒酶活性的抑制作用，研究发现teloRZ对人工合成的端粒酶RNA组分有专一的切割活性，当把teloRZ加入人肝癌细胞系HepG2和Huh-7的端粒

19、酶提取物中时，可有效抑制端粒酶的活性，表明RZ是一种很强的端粒酶抑制剂。 1.2.3.3、逆转录酶抑制剂 端粒酶是一种逆转录酶，因此逆转录酶抑制剂能抑制端粒酶活性，3-叠氰胸甙(3-azidothymidine, AZT)是一种用于艾滋病治疗的逆转录酶抑制剂，Yegorov等25研究发现它能抑制端粒酶的功能而诱导鼠成纤维细胞凋亡，但这种作用是可逆的。Comez等26的实验则进一步证实长期应用AZT治疗，可使HeLa细胞的端粒明显缩短，AZT的衍生物3-叠氨胸甙三磷酸盐(3-azidothymidine triphosphate, AZTTP)也被证明能抑制端粒酶的活性。逆转录酶抑制剂作用广泛，

20、副作用大，不是理想的抗肿瘤药物，因此有必要针对端粒酶的特殊性，寻找作用强特异性高新型逆转录酶抑制剂。 1.2.3.4、核苷类似物 Fletcher等27报道7-脱氮-2-脱氧腺嘌呤核苷酸(7-deaza-dATP)和7-脱氮-2-脱氧乌嘌呤核苷酸(7-deaza-dGTP)在端粒合成端粒重复序列时可掺入端粒DNA序列而导致端粒不稳定甚至缩短，这为设计的端粒抑制剂提供了思路。 1.2.3.5、诱导分化药物 正常人类干细胞分化为成熟体细胞后，端粒酶活性受到抑制，而当细胞癌变后端粒酶又重新被激活，此提示诱导分化可能会抑制端粒酶的活性。Xu等28研究发现用维甲酸(RA)和125-(OH)2维生素D3分

21、别诱导人早幼粒白血病HL-60细胞分化为成熟的粒细胞和单核细胞时，端粒酶活性明显下降，细胞停滞于G1期，增殖速度减慢。而且丁酸钠诱导人白血病细胞K562分化，也得到了同样的结果，并发现端粒酶活性受抑程度与分化程度呈正相关。 1.2.3.6、端粒酶蛋白抗体 1995年，四膜虫的端粒酶蛋白最先克隆成功，它包括二个亚单位P80和P95，P80能与端粒酶RNA特异性地结合，与端粒酶的活性密切相关，抗P80抗体能特异性地免疫沉淀端粒酶活性10。人端粒酶相关蛋白TP1与P80具有很高的同源性，抗P80抗体也能抑制人端粒酶活性29。1.3 HTERT基因在肿瘤治疗中的研究进展 HTERT基因在肿瘤治疗发展前

22、景 肿瘤的发生是多阶段、多步骤的复杂过程。原癌基因的激活、抑癌基因的失活是肿瘤发生的重要分子基础。肿瘤细胞获得无限增殖特性而成为永生化细胞，这其中端粒酶起了重要作用。端粒酶是一种特殊的DNA聚合酶，具有逆转录酶活性，由人类端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTER)、端粒酶相关蛋白1(human telomeraseassociated protein 1;hTEP1)和端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）三组分构成，能以自身的RNA为模板，反转录成端粒的重复单元TTAGGG加到人染色体末端，阻止端粒随

23、细胞分裂而缩短，使细胞绕过衰老途径成为永生化细胞，导致人类肿瘤的发生。迄今发现近90%的肿瘤细胞都有端粒酶活性，而正常细胞或组织几乎没有端粒酶活性。端粒酶已成为当今肿瘤新的标志物和肿瘤治疗的新靶点，抑制端粒酶活性已成为肿瘤治疗的一种新策略。本文就最近几年来端粒酶抑制剂与肿瘤治疗关系作一综述。端粒酶抑制剂用于肿瘤治疗具有广阔的应用前景，除上述这些抑制剂外，进一步研究可大致归纳为以下几个方面：(1)阻断端粒酶复合物的组装和转运过程，包括阻断SnRNA在细胞核内的转录，RNA的修饰、加工、转运至细胞质并与蛋白质组装，再返回细胞核的各步骤。(2)阻断端粒DNA与端粒酶活性位点的结合。(3)通过对端粒酶活性细胞内调节机制的调空阻断端粒酶活性，如p53、p21、cmyc、sp1基因等。(4)阻断端粒酶蛋白催化亚基的功能。(5)制备突变端粒酶RNA与内原性RNA竞争端粒酶蛋白。(6)端粒酶蛋白组分抑制剂。(7)端粒酶细胞周期依赖性调节。、HTERT在肿瘤治疗中的研究进展问题端粒酶是当今最引人注目的抗肿瘤治疗新靶点之一，端粒酶抑制剂有可能成为一种广谱、高效、低毒副作用的抗肿瘤制剂，美国已将此列为肿瘤治疗的新目标，国内也开始了这方面的研究。