溶菌酶结晶法提取及其酶活力的探讨_黄赞良

1、 作为一种糖苷水解酶的溶菌酶,又称 N-乙 酰胞壁质聚糖水解酶或胞壁质酶,是一种能水解 致病菌中黏多糖的碱性酶。溶菌酶广泛存在于鸟 类的蛋清及哺乳动物的尿液、泪液、血液、体液 (如淋巴液 、组织 (如肝 、肾细胞内等 1。主要 通过破坏细胞壁中的 N-乙酰胞壁酸 (NAM和 N-乙酰氨基葡糖 (NAG之间的 -1,4糖苷键,使 细胞壁不溶性黏多糖分解为可溶性糖肽,导致细 胞壁破裂而使细菌溶解。溶菌酶对人体无毒副作 用,是一种安全的天然防腐剂,具有抗病毒、抗 菌、抗肿瘤之功效。可用作为药物制剂、防腐剂、 基因与细胞工程中细胞融合剂等 2。作为碱性酶的溶菌酶,其来源不同,水解细 胞壁的性能也表现为

2、较大差异 3。溶菌酶水解微 生物细胞壁的作用机理是破坏细胞壁结构中的肽 聚糖, 作用位点是 NAM 与 NAG 碳原子间的 -1.4糖苷键 4。肽聚糖作为微生物细胞壁的主要成份 (骨架 ,是 NAG 与 NAM 通过 -1,4 糖苷键交 替排列形成的多层网状结构的共聚物 5。肽聚糖 结构中的任何化学键断裂,都能促使细胞壁中的 肽聚糖分解,导致细菌细胞壁被破坏,从而体现 溶菌酶的溶菌特性 6。近年来,根据不同原料及溶菌酶的特性,提 取分离溶菌酶的方法有结晶法、反胶团萃取法、 离子交换法、色谱法、亲和层析法等。结晶法这 一传统的方法,是由 Mayer Abraham 等提出并获 得结晶状溶菌酶 7

3、。本文利用湖光岩地区的鹌鹑 蛋为提取原料,采用结晶法提取分离溶菌酶,进 而利用重结晶的方法反复精制,可提取到所需纯 度的溶菌酶晶体 8。1实验1.1主要仪器、试剂与材料UV-29200 紫外可见分光光度计 ; JJ-a 数控恒 温磁力搅拌器 ; M304781 离心机 ; DSX-280B 蒸 气压力灭菌锅 ; KYC-111 摇床 ; SW-CJ-2F 超净 工作台 ; FD-1B-50 冷冻干燥机 ; 2X-15D 旋片式 真空泵 ; R201 旋转蒸发仪 ; Sorvalls Upert-21 高 速离心机 ; YP-5002 电子天平。新鲜湖光岩鹌鹑蛋,购置于湖光岩农贸市场。 1.2实

4、验方法溶菌酶结晶法提取及其酶活力的探讨黄赞良,谈海玉,邓彩思,张兆霞 *,李泳 *(广东海洋大学,广东 湛江 524088摘要:以湖光岩鹌鹑蛋为原料,采用结晶法从蛋清中分离提取溶菌酶。探讨不同条件对溶菌 酶收率及活性的影响,确定溶菌酶最佳的分离提取条件:盐析NaCl质量分数为5.1%,pH=10.7,盐 析时间为120h,收率达到 0.378%,酶活力达到 13700 U/mg。关键词:盐析法;溶菌酶;酶活力中图分类号:S188 文献标识码:A 文章编号:1004-275X(201705-083-04_收稿日期:2017-04-25基金项目:广东海洋大学团队项目(项目编号:C13435, 大学

5、生创新创业项目(项目编号:CXXL2016152。 作者简介:黄赞良,广东海洋大学,制药工程专业,大学生。*通讯作者:张兆霞,李泳,广东海洋大学教师,从事生物酶相关方面的科研工作。1将新鲜鹌鹑蛋洗净晾干、用无菌注射器收 集鹌鹑蛋清液并搅拌均匀后,用纱布过滤去除蛋 清中的卵带备用。2 取 一 定 量 蛋 清 液, 加 入 适 量 NaCl 后 搅 拌 均 匀, 用 1M 的 NaOH 溶 液 调 节 蛋 清 液, 使 pH=10.7左右, 投入适量溶菌酶晶种后, 放置于 4 环境大约 5d,待析出溶菌酶晶体后,冷冻干燥得 干粉溶菌酶。1培养基的配制取 5g NaCl,3.0g 牛肉浸取物,10.

6、0g 蛋白胨, 放置于 1 L 蒸馏水中溶解,加入 2%的琼脂液, 用酸碱液调节 pH 为 7.0,用三角瓶分装成斜面, 在 120的水蒸气条件下灭菌 20min 后备用。 2底物的制备用 0.5mL 的无菌水振荡溶解冻干溶壁微球菌, 并将菌体接种于培养基斜面中,于 25培养 2 d, 备用(如果需要,可再次接种扩培 。用无菌水洗 涤菌体,5000r/min 离心 15min,收集沉淀菌体, 反复洗涤至无蛋白 (以考马斯亮蓝 R250蛋白质显 色法 9检测 ,冷冻干燥得干粉菌体。用 0.5g 干 粉菌体和适量的 0.1mol/L、pH=6.2的磷酸缓冲溶 液,于玛瑙研钵中研磨 5min后,稀释

7、至 3040mL备用。1酶液的制备 :以 0.1% 的氯化钠溶液作为 激活剂,称 5mg 干粉溶菌酶与 0.1mol/L、pH=6.2 的磷酸缓冲液溶配制成 5.0×10-2mg/mL的溶菌酶 溶液。2 1个酶活力单位:在 1min、 pH= 6.2的条件下, 使溶菌酶溶液 OD 450值降低 1×10-3个单位定义为 1个酶活力单位。以标准溶菌酶的检测条件为固 定的标准测定条件。酶 活 力 单 位 计 算 公 式 :在 光 密 度 OD 450为 0.50.6 的范围内,酶活力单位 (U/mg = (ODt=0-OD t=60/样品的质 量 (mg×10003酶

8、活力的测定。将底物液与溶菌酶溶液分 别于常温水浴中保温 10min,测量底物液的 OD 450值作为空白值,接着加入 0.2mL 溶菌酶溶液迅速 摇匀,并开始记时,每隔 1min 测 1 次 OD 450值。 2结果与讨论2.1盐析时间对溶菌酶活性的影响由于溶菌酶处于盐析条件下,其活性随时间 而减退,所以确定适当的盐析时间是十分重要的。 在盐析实验过程中,每隔 20h 取样一次,并测定 鹌鹑蛋清的比酶活,结果见图 1。图 1盐析时间对溶菌酶收率的影响由图 1知,在盐析 20h 时,酶活力测定最高 为 16100 U/mg,随着盐析时间的增加,酶活力逐 步下降,在盐析 120h 时,酶活力为 1

9、3700 U/mg, 此后,酶活力迅速下降。说明随盐析时间增加, 酶活力逐渐下降。2.2pH 值对溶菌酶活性的影响每隔 0.5个 pH 值单位取一次溶菌酶溶液,并 测定比酶活,结果见图 2。图 2pH 值对溶菌酶活性的影响由图 2知,溶菌酶在 pH=6.5时酶活力最高, 为 13700U/mg,升高或降低溶菌酶溶液的 pH 值, 酶活力都将迅速下降。2.3温度对溶菌酶活性的影响改变溶菌酶溶液的温度, 每隔 10 取样一次, 并测定其溶液的比酶活,结果见图 3。图 3温度对溶菌酶活性的影响由图 3可见,在 2090的范围内,溶菌酶活 性于 50 时最高,为 13700 U/mg。2.4盐析时间对

10、溶菌酶收率的影响在盐析过程中,每隔 20h,测定一次溶菌酶的 收率,结果见图 4。图 4盐析时间对溶菌酶收率的影响由图 4 可见,溶菌酶的收率在 0120h的盐析 时间内是逐渐增加的,且盐析达到 120h 时,酶的 收率最高。当盐析超过 120h 后,酶的收率则有些 下降。所以,鹌鹑蛋溶菌酶的盐析时间应不小于120h。2.5pH 值对溶菌酶收率的影响选用不同 PH 值条件下,提取分离溶菌酶,每 隔 0.5个 pH 值单位,测定一次溶菌酶的收率,结 果见图 5。图 5pH 值对溶菌酶收率的影响由图 5可知,pH 值介于 9.010.7范围内,溶 菌酶的收率随 pH 的升高而逐步增大,当 pH =

11、 10.7 时,溶菌酶的收率达到最高。当 pH 值超过 10.7时,随着 pH 值的增加,溶菌酶的收率又迅 速降低, 所以, 溶菌酶的盐析 pH 值应在 10.7左右。 2.6NaCl 的质量分数对溶菌酶收率的影响选用不同 NaCl 的质量分数, 盐析分离溶菌酶, 每隔 0.5个质量分数单位, 测定一次溶菌酶的收率, 结果见图 6。图 6NaCl 的质量分数对溶菌酶收率的影响由图 6可知,NaCl 质量分数介于 3.0%5.1%范围内,随质量分数的升高溶菌酶的收率逐步提 高, 当 NaCl 质量分数达 到 5.1%时, 溶 菌 酶 的 收率最高。随着 NaCl 质量分数继续增大,溶菌 酶的收率

12、反而逐步下降,所以,溶菌酶的盐析 NaCl 质量分数应在 5.1左右。3结论采用 NaCl 作为盐析剂,于等电点分离并结晶溶菌酶。得出提取分离鹌鹑蛋溶菌酶最佳条件 :盐 析 用 5.1% 的 NaCl 溶 液 的 质 量 分 数、10.7的 pH、120h 的盐析时间。获得溶菌酶活力最高达 13700 U/mg,溶菌酶的收率为 0.378%。溶菌酶在 工农业生产中应用广泛,溶菌酶因来源不同,所 得分子量、结构及性质等会有所不同,因而,应 根据具体提取物质,来制定不同的分离工艺路线。参考文献 :1 陈慧英, 吴晓英, 林影.溶菌酶分离纯化方法的研究新进 展J.广东药学院学报, 2003, 19(

13、4:356-358.2 谷绒, 车振明, 万国福.溶菌酶在食品工业中的应用J.保 鲜与加工, 2006, 6:5-6.3 王镜岩, 朱圣庚等.生物化学, 北京:高等教育出版社(第三 版, 2002:394-39. 4 Datta D., Bhattacharjee S., Nath A. Separation of ovalbumin from chicken egg white using two-stage ultrafiltration techniqueJ. Sepatation and purification technology, 2009, 66:353-361.5 荣晓花.溶

14、菌酶的研究进展J.中国生化药物杂志, 1999(6:319-320.6 Vaidya A.A., Lele B.S., Kulkarni M.G. Thermmoprecipiyion of lysozyme from egg white using copolymers of N-isopropylaacrylaamide and acidic monomersJ. J. Biote., 2001(56:5681-5687.7 黄建安, 欧阳建华.溶菌酶制备技术研究进展J.江苏食 品技术与发酵, 2002, 2:20-23.8 Alderton G., Ward W., Fevold H.I

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