实验四 小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察

1、实验四 小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察【实验目的】 1掌握细胞器活体染色技术。2观察和了解活细胞线粒体的形态、结构和分布特点。【实验原理】对细胞的结构及功能的研究历来是细胞生物学的主要内容。活体染色是指对生命有机体的细胞或组织能着色但又对其无害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理病理状态。活体染色根据染色剂的性质和染色方法的不同，分为体内活染和体外活染两类。体内活染是将胶体状的染料溶液注入动植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，使这些特殊结构易于被

2、识别。体外活染又称超活染色，它是将动植物分离出部分细胞或组织小块，用染料溶液浸染，染料被选择性地固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定，堆积在细胞内某些特殊部分，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用，从而使样品着色。不是任何染料都可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料。活体染色剂有以下选择原则：对细胞无毒性或毒性极小；具有电化学特性；配成稀淡的溶液来使用（如超低浓度Janus greenB:1/5000）；具有专一性（特异性）；一

3、般是以碱性染料最为使用，可能因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性。本实验常用的活体染色剂是詹纳斯绿B，它是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态蓝绿色）；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。 中性红（neutral red）也属碱性染料，对植物液泡系的染色有专一性。【实验用品】1. 材料健康小鼠，小烧杯，眼科剪，双凹片，载玻片，镊子，盖玻片，显微镜，解剖盘。2. 试剂1/5000詹纳斯绿B溶液，Ringer溶液，蒸馏水。【实验步骤】1. 用断头法处死小白鼠（注意

4、血要放干净），置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝组织，选取边缘较薄的肝组织0.5cm3，放入小烧杯中，用Ringer液冲洗去血污。2. 在干净的双凹片的凹穴中，滴加1/5000詹纳斯绿B溶液，再将肝组织块2移入染液中，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上面部分半露在染液外，这样细胞内的线粒体酶系可充分得到氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即成（一般需染20-30min）。3. 吸取染液，用眼科剪将组织块着色部分剪下重置小烧杯中，滴加Ringer溶液0.5ml，用剪刀充分剪碎制悬液。4. 取上述细胞悬液滴片，加盖玻片，高倍镜下观察。【实验结果】理想状态下，小鼠的肝细胞细胞质中的线粒体应该

5、被染成蓝绿色，且分布均匀。经过高倍镜镜检的结果如图1，图2，我们可以观察到圆形较大的肝细胞和散布在周围的红细胞。染色结果不是特别明显。图1 高倍镜观察肝细胞线粒体（10×40）图2 高倍镜观察肝细胞线粒体（10×40）【结果分析与讨论】1.在理想状态下，小鼠肝细胞细胞质中的线粒体应该被染成蓝绿色，但是在实际观察中，线粒体呈现浅绿色甚至无色，可能原因是：a.染色时间不够长，导致詹纳斯绿B染色不够充分b.肝组织剪得较大较厚，导致染料扩散速度太慢，大部分的细胞没有染色。2.在显微镜下观察时，可发现红细胞的数量远远多于肝细胞数量，出现这种情况可能是由于处死小鼠时放血不充分导致大量血液残留在肝脏内，或是取出肝组织是用Ringer液冲洗不够充分，部分血液残留在了肝脏表面，最终残留在了细胞悬液里。【拓展】使用肝细胞边缘的原因：1. 肝细胞