大片段克隆载体研究进展

1、 大片段克隆载体研究进展3樊颖伦 1 赵开军1,233(1中国农业科学院作物科学研究所 农业部作物遗传育种重点实验室 北京 100081(2国际水稻研究所中国办事处 北京 100081摘要 DNA 克隆技术是分子生物学研究中一项重要的技术手段 。自第一个质粒载体 pSC101作为克隆载体以来 , 随着分子生物学技术的发展 , 克隆载体的整体结构 、 容载能力和转化效率都有 了很大的改善 。 尤其是人类基因组计划的实施 , 产生了 Y AC 和 BAC 克隆体系 。 随着植物基因组 计划的进行 , 又产生了既能够克隆大片段 DNA 互补实验的载体 。 综述了几种常用大片段克隆载体 Y AC 、

2、BAC BAC 、 PAC 用 , 并对克隆载体的发展作了展望 。 关键词 克隆载体 人工染色体 基因组文库收稿日期 :2003209215 修回日期 :20042012083农 业 部 “ 948” 项 目 (20012203 ; 国 家 “ 863” 计 划 资 助 项 目(2001AA222151,2002AA2Z 1001215 。33通讯作者 , 电子信箱 :zhaokjmail. caas. net. cn1 自 C ohen 一 质 粒 载 体 pSC101, 随着分子生物学技术的 发展 , 越来越多的克隆载体相继出现 , 这些载体的 发展推动了结构基因组学和功能基因组学研究 。

3、 同时随着人类基因组计划和植物基因组计划的实 施 , 克隆载体的整体结构 、 克隆能力和转化效率等 都有了长足的发展 。可以把克隆载体的发展划分 为三个阶段 :第一 阶 段 以 质 粒 (plasmid 、 噬 菌 体 (2bacteriophage 、 柯斯质粒 (cosmid , 又称粘粒 为主 , 主要特点是载体在宿主细胞内稳定遗传 、 易分离 、 转化效率高 , 但是克隆容量有限 , 一般小于 45kb 。第二阶段的克隆载体则突破了上述载体容量 , 显著特点是载体的容载能力扩大 , 约 100350kb , 主要有酵母人工染色体 (yeast artificial chrom os o

4、me , Y AC 、细 菌 人 工 染 色 体 (bacterial artificial chrom os ome ,BAC 以及源于噬菌体 P1的人工染色 体 (Pl 2derived artificial chrom os ome ,PAC 。第三个发展阶段是以近几年发展起来的双元 细菌人工染色体 (binary BAC ,BI BAC 和可转化人工体(trans formation 2com petentartificialChrom os ome , T AC , 这些载体不仅具有较大的克隆容量 , 而且具备了直接转化植物进行功能互补实验 的功能 。 几种克隆载体性质的比较见表 1

5、。表 1 几种克隆载体性质的比较T able 1 Comp arison of some cloning vectors载体宿主载体容量遗传稳 定性嵌合 性 可否转 化植物 质粒 大肠杆菌 1520kb稳定低否 噬菌体 大肠杆菌 1720kb 稳定 低 否 柯斯质粒 大肠杆菌 3045kb 稳定 低 否 Y AC 酵母 3501000kb 不稳定 高 否 BAC 大肠杆菌 100300kb 稳定 低 否 Pl 大肠杆菌 100kb 稳定 低 否 PAC 大肠杆菌 100300kb 稳定 低 否 BI BAC 大肠杆菌 农杆菌 100300kb 稳定 低 可 T AC 大肠杆菌 农杆菌 100k

6、b 稳定低可2 大片段克隆载体大片段克隆载体 Y AC 、 BAC 可以说是随着人类 基因组计划的实施而产生的 , 用 Y AC 、 BAC 载体构 建基因组文库并建立物理图谱使基因组计划顺利 进行 。 进行植物基因分离时 , 常要求对候选克隆进 行功能互补实验 , 由于农杆菌介导转化技术的成 熟 , 产生了能够将候选克隆直接通过农杆菌介导进 行功能互补实验的大片段克隆载体 BI BAC 、 T AC 。 近几年来 , 又出现了可以把多个基因聚合并转化的第 24卷第 3期中 国 生 物 工 程 杂 志CHI NA BI OTECH NO LOGY2004年 3月多基因转化载体系统 。211 酵

7、母人工染色体 (YAC真正的人工染色体要在寄主细胞中稳定地复 制并遗传下去 , 必须具备三个元件 :复制起始区 (origin of replication , 参与染色体 DNA 复制起始结 构的形成 ; 着丝粒 (centromere , 负责染色体向子细 胞的传递 ; 端粒 (telomere , 对染色体 DNA 两个末端 起封口和保护作用 。 Murray 等 (1983 利用这三个 元件构建了第一个酵母人工染色体 。Y AC 载体的突出特点是容载能力大 , 如动物的 Y AC 文库平均插入长度达 9001000kb 。 植物 Y AC 文库平均插入片段一般为 100350kb ,

8、其原因是植 物细胞较大 , 有硬而厚的细胞壁 , 同时细胞内多糖 和 DNA 水解酶类多 , 难以得到超大分子量的基因 组 DNA 。 由于 Y AC 插入片段大 , 构建基因组文库 时 , ,可能 ,虽然 Y AC , Y AC 克隆 的稳定性较差 , , 具有自身难以克服 的缺点 :1 (chimerism , 即一个 Y AC 克隆中的插入子可能来自两个或多个不同的片段 , 嵌合体的比例达到 10%50%, 这种现象使染色体 步行 (chrom os ome walking 和基因分离难度加大 ;2 Y AC 克隆的稳定性差 , 插入片段存在重排和丢失现 象 , 这对染色体物理图谱的构建

9、和基因分离都十分 不利 ;3 插入片段的分离和纯化困难 ;4 转化效率 低 1。212 细菌人工染色体 (BACBAC 载体系统是在大肠杆菌 F 因子的基础上 发展而来的 , F 因子具有稳定遗传的特点 , 其复制 是严谨型的 , 在每个细胞中仅有 12个拷贝 , 减小 了插入片段发生重组的机率 , 并且 F 因子能够携带 1Mb 的外源片段 。 1992年 ,Shizuya 等 2利用 F 因子 的 oriS 、 repE 、 par A 和 par B 等与复制和调节拷贝数 有关的基因 , 以氯霉素抗性基因为选择标记 , 并利 用电激穿孔转化大肠杆菌 DH10B , 构建了第一个细 菌人工

10、染色体载体 pBAC108L , 它能够克隆约 300kb 的外源片段 , 但是它只有转化选择标记而无重组子 选择标记 , 重组子的选择必需通过杂交进行验证 。 为了进一步方便 BAC 克隆的筛选 , 将 lacZ 基因引 入了 pBAC108L 的克隆位点中 , 构建了 pBeloBAC11 载体 1, 这样重组子可以通过蓝白斑进行筛选 , pBeloBAC 11载体是第二代 BAC 载体的代表 。 BAC 载体 pIndig oBAC 源自 pBeloBAC11, 由于 lacZ 基因 的 3 末端的一个点突变 , 能够使 pIndig oBAC 载体产 生比 pBeloBAC11更深的蓝

11、色 3。M ozo 等 4将 卡 那 霉 素 抗 性 基 因 插 入 到 pBeloBAC11的氯霉素抗性基因的 Eco R 位点 , 构 建了 pBeloBACK an 载体 , 使 pBeloBACK an 具有了卡 那霉素筛选标记 。 Frengen 等 5构建了 pBACe316载体 , 其多克隆位点位于蔗糖致死基因 sacB 上 , 这 样重组子可以在含有蔗糖的培养基上进行选择 。 Fu 等 (2000 在 pBACe316载体的基础上构建了多克 隆位点为 Mlu 和 Not 的 载体 pNOBAC1, Mlu 和 , 主要作用 ,。将 Cre lox P 特异位点重组系统引入 载体

12、 pBeloBAC11, 构建了 pBAC wich 载体 , 为基 因克隆和鉴定提供了一种新载体 。 Cre lox P 特异 位点重组系统使外源基因可以插入到染色体特定 的位点 , 可以在一定程度上消除由于外源基因随机 整合到染色体而引起的 “位置效应” 。 Choi 等 6以 pBAC wich 载体构建了棉花的 BAC 文库 , 用基因枪 法使部分克隆转化烟草 , 并证明外源 DNA 片段整 合到染色体的特定位点上 。BAC 载体的容载能力一般为 100350kb , 虽然 容量没有 Y AC 载体大 , 但是 BAC 具有更多优点 :1 以大肠杆菌为寄主 , 转化率高 , 构建 BA

13、C 文库比 Y AC 文库更容易 ;2 BAC 载体以环型超螺旋状态存 在 , 从大肠杆菌中提取质粒较方便 , 而从酵母中分 离 DNA 较困难 ;3 BAC 的复制子来源于 F 因子 , 可 稳定遗传 , 嵌合及重组现象少 ;4 可以通过菌落原 位杂交来筛选目的基因 , 方便快捷 ;5 BAC 载体在 克隆位点的两侧具有 T 7和 S p6聚合酶启动子 , 可 以用于转录获得 RNA 探针或直接用于插入片段的 末端测序 1。基于上述优越性 ,BAC 载体成为大片段基因组 文库的主要载体 , 成为基因组测序和基因组的遗传 图谱和物理图谱构建的主要工具 6。但是 Y AC 、 BAC 载体不能直

14、接进行植物转化 , 在候选克隆的转 化互补实验中需要将外源片段进行亚克隆 , 因而工 作量大 , 同时也有漏失目的 DNA 片段的可能 。因 此 , 可直接用于植物转化的大片段双元载体便应运 31第 3期 樊颖伦 等 :大片段克隆载体研究进展 而生 , 具有代表性的载体系统有 BI BAC 和 T AC 。 213 双元细菌人工染色体 (BIBAC1996年 , Hamilton 等 7结合 BAC 载体和 T i 质 粒的特点 , 构建了双元 BAC 载体 BI BAC2, 该载体在 结构上具有 BAC 的复制系统 , 又加入在农杆菌中 起作用的 Ri 复制子和抗卡那霉素筛选标记及 T 2

15、DNA 的左右边界 , 因此 BI BAC 能在大肠杆菌和根 癌农杆菌中穿梭复制 。 Hamilton 等 7已用其将一段 30kb 的酵母 DNA 和一段 152kb 的人类基因组 DNA 通过农杆菌介导成功地导入烟草核基因组 , 并证明 能够稳定遗传 。 Bancroft 等 8构建了 pC LD04541双 元载体 , 在 T 2DNA 左右边界之间有一个 dBS 多位 点接头 , 使重组子克隆产生更深的蓝色 , 这在低拷 贝的双元载体中具有一定的优势 。214 P1克隆系统和源于 P1的人工染色体 (PAC 1994年 ,I oannou 等 9创建了源于 P1色体 (PAC , PA

16、C 载体以 F P1础构建 , 兼有二者的特点 ,PAC DNA 没 载体可以插入约 300kb , 传 及 高 效 扩 增 。 PAC 除具有许多 BAC 载体的特征外 , 它的多克隆 位点位于蔗糖诱导型致死基因 sac B 上 , 通过加入 蔗糖和抗生素的培养基筛选出来的克隆都是含有 插入片段的重组子 。 但是 ,PAC 载体自身片段较大 (约 16kb , 构建文库没有 BAC 载体 (约 78kb 效 率高 。 PAC 载体在基因分离和序列分析当中 , 可作 为 Y AC 连续克隆群的重要补充 , 日本水稻基因组 计划 (RG P 已把水稻的 PAC 文库用于物理图谱的 构建 。215

17、 可转化人工染色体 (TACLiu 等 10结合 PAC 和双元载体的特点 , 构建了 T AC 载体 2p Y LT AC7,T AC 载体具有 P1复制子和 Ri 质粒 pRiA4复制子 , 能在大肠杆菌和农杆菌中穿梭 复制 。 p Y LT AC7在其 T 2DNA 右边界处插入了植物 选择标记潮霉素磷酸转移酶基因 (hpt 和 Pnos 启 动子 。 在 T AC 载体中重组筛选标记是卡那霉素抗 性基因和 sacB 基因 。 Liu 等以 p Y LT AC7为载体构 建了拟南芥的基因组文库 , 并把部分克隆通过农杆 菌介导转化拟南芥 , 获得了转化植株并能稳定遗 传 。 为了证明 T

18、 AC 载体系统在图位克隆中的可利 用性 , 用与拟南芥重力感应基因 sgr 1紧密连锁的 标记筛选文库 , 构建了 sgr 1的跨叠克隆群 , 并把含有 sgr 1基因的 2个 T AC 克隆转化到 sgr 1突变体 中 , 使其恢复了重力感应 10。由于 Pnos 启动子在单子叶植物中的启动能力 较弱 ,Liu 等 11对 p Y LT AC7进行了改造 , 选用水稻 肌动蛋白 Act 强启动子 , 把植物选择标记基因 hpt 替换为 bar 基因 , 构建了 T AC 载体 p Y LT AC17。 bar 基因 编 码 对 磷 化 麦 黄 酮 (PPT 和 双 丙 胺 类 (biala

19、phos 除草剂的抗性 , 适合用作禾本科作物转 化体的选择 。 Liu 等用 p Y LT ACl7载体构建了普通 六倍体小麦的基因组文库 , 对部分较大插入片段 (150kb 克隆的遗传稳定性分析表明 T AC 也存在插 入子重组现象 。用 bar , 在候选克隆的 , 假阳性, T AC 载 , 构建了载体 p Y LT AC27, 并构建了水稻 “ 明恢 63” 的基因组文库 12。该载体以 Act 为启 动子 , hpt 为筛选标记基因 , 该载体系统可以高效应 用于单子叶植物的基因图位克隆及功能分析 。 T AC 载体与 BI BAC 载体一样具有克隆大片段 DNA 和借助于农杆菌

20、直接转化植物的功能 。 T AC 和 BI BAC 载体除具有 BAC 载体的优点外还具有以 下优越性 :1 具有大肠杆菌和农杆菌的复制子 , 是 一个穿梭质粒 , 在大肠杆菌和农杆菌中均保持稳 定 。 2 可通过农杆菌介导直接进行基因功能互补 实验 。 T AC 载体与 BI BAC 载体相比 , 首先大肠杆菌 中的复制起点不同 ,T AC 源于 P1噬菌体 ; 而 BI BAC 源于 F 因子 。其次 , T AC 载体中具有 P1裂解子 (lytic replicon , 可以在 IPTG 的诱导下产生 520个拷贝 , 提高了质粒产量 。目前已经构建了水稻 、 小麦 、 拟南芥 、 大

21、豆 、 金 鱼草等植物的 T AC 基因组文库 , 并从拟南芥中分 离出了 filamentous flower 基因 、 kor 1基因 1014。 216 多基因转化载体系统生物体的大部分性状由多基因控制 。生物基 因工程研究正从单基因导入转向多基因导入 , 但是 由于现有技术条件的限制 , 多基因转化还存在一定 的困难 15。 Surekha 等 16把 Act 启动子和 Nos 启 动子结合构建了双启动子的 pAH 和 pAB 双元载 体 , 把玉米 Ubi 启动子和 Nos 启动子结合构建了 双启动子的 pUH 和 pUB 双元载体 , 用于两个或多41中 国 生 物 工 程 杂 志

22、 第 24卷 个基因的聚合并进行了水稻转化 。 Lin 等 17建立 了能高效连接和转移多个基因的多基因排列和转 化载体系统 , 该系统由受体载体 p Y LT AC747和供 体载体 p Y LV 、 p Y LS V 组成 , 它利用 Cre lox P 重组系 统和寄主体内的核酸内切酶将基因进行排列 , 使多 个基因依次转移到 p Y LT AC747载体 , 再将含有多 个外源基因的 T AC 克隆转化植物 。他们还利用该 系统把 10个外源基因片段 (包括 6个抗病基因 克 隆到 p Y LT AC747载体 , 并进行水稻转化 , 通过 RT 2 PCR 检测到了外源基因的 cDN

23、A 片段 。3 现状与展望克隆载体的应用推动了分子生物学 、 遗传学等 学科的发展 , 克隆载体成为基因工程研究的有力工 具 。 Y AC 载体一经产生就成为各种基因组计划的 主要克隆载体 , 人工染色体载体的应用弥补了以前 载体容量较低的缺点 , 、 图谱 、 。植物的 BI BAC 和 , 则加速了植物 基因组研究 , 基因图位克隆和基因的功能分析 。但 是 ,Y AC 、 BAC 、 T AC 等载体的插入子仍存在一定的 嵌合 、 重组现象 , 尤其是含有较大串联重复序列插 入子 (180kb 的克隆 11,18。在人工染色体上应用 Cre lox P 特异位点重组 系统进行植物转化 ,

24、 可以在一定程度上消除外源基 因随机插入受体染色体而引起的 “ 位置效应” , 使外 源基因的整合 、 表达得到一定的改善 。高效 、 特定 组织表达启动子的应用 , 将减小转化体中基因沉默 现象 。 在目的基因的定点整合以及目的基因特定 组织 、 特定时期的表达方面还需进一步优化和改造 载体 。基于生物体的许多重要性状牵涉到复杂的生 理生化反应 , 受多基因或基因簇的控制 。研究者们 对发展多基因转化系统 , 将多个基因导入到植物进 行了探索 , 并且成功地实现了多个基因在植物中的 表达 。 这些体系的建立无疑对植物基因工程具有 重要意义 。 为了实现多个基因在植物中的表达 , 可 以采取两

25、条途径将目的基因克隆到表达载体上 , 一 是将多个目的基因用表达结构隔开或直接将多个 基因融合克隆到表达载体上 , 二是多个目的基因分 别构建多个表达载体 。这些途径都要求有较大容 量的人工染色体作为载体进行克隆和转化 。同时 还需优化发展相应的基因转化技术 , 将大容量的载 体能够高效地导入到受体中 , 并保证多个目的基因 与植物基因组整合后不发生分离和丢失 。多基因 的转化将会成为今后基因工程的重点 , 多基因工程 研究时期即将到来 15。参考文献 1Shizuya H , K ouros 2M ehr H. The development and applications of the

26、bacterial artificial chrom os ome cloning system. K eio Journal of M edicine ,2001,50(1 :2630 2Shizuya H ,Birren B ,K im U ,et al. Cloning and stable maintenance of 3002kilobase 2pair fragments in E scherichia coli using an F 2factor 2 based vector. PNAS ,1992,89( 8797 3K im , Birren , T , al. C ons

27、truction and of a chrom os ome library. ics ,34( T S , Shizuya H , et al. C onstruction and of the IG F Arabidopsis BAC library. M ol G en G enet ,1999,99:305313 5Frengen E , W eichenhan D , Zhao B , et al. A m odular , positive selection bacterial artificial chrom os ome vector with multiple clonin

28、g sites. G enom ics ,1999,58(3 :250253 6Choi S , Begum D , K oshinsky H , et al. A new approach for the identification and cloning of genes :thepBAC wich system using Cre lox S ite 2specific recombination. Nucleic Acids Res ,2000,28(7 : e19 7Ham ilton C M ,Frary A ,Lewis C ,et al. S table trans fer

29、of intact high m olecular weight DNA into plant chrom os omes. PNAS , 1996, 93 (18 :99759979 8Bancroft I ,Love K,Bent E ,et al. A strategy inv olving the use of high redundancy Y AC subclone libraries facilitates the contiguous representation in cosm id and BAC clones of 117Mb of the genome of the p

30、lant Arabidopsis thaliana . W eeds W orld ,1997,4(2 :19 9I oannou P A ,Amerm iya C T , G arnes J ,et al. A new bacteriophage P12derived vector for propagation of large human DNA fragments. Nature G enetics ,1994. 6:8489 10Liu Y G, Shirano Y, Fukaki H , et al. C om plementation of plant mutant with l

31、arge genom ic DNA fragments by a trans formation 2 com petent artificial chrom os ome vector accelerates positional cloning. PNAS , 1999,96(11 :65356540 11Liu Y G, Nagaki K, Fujita M ,et al. Development of an efficient maintenance and screening system for large 2insert genom ic DNA libraries of hexa

32、ploid wheat in a trans formation 2com petent artificial chrom os ome vector. Plant J ,2000,23:687695 12Liu Y G, Liu H M , Chen L T , et al. Development of new trans formation 2com petent artificial chrom os ome vectors and rice genom ic libraries for efficient gene cloning. G ene ,2002,282:247 25551

33、第 3期 樊颖伦 等 :大片段克隆载体研究进展 13Sawa S , W atanabe K, G oto K, et al. Filamentous flower , a meristem and organ identity gene of Arabidopsis , encodes a protein with a zinc tinger and H MG 2related domains. G enes Development , 1999,13(9 :10791088 14Sato S , K ato T , K akegawa K, et al. R ole of the puta

34、tive membrane 2bound endo 2l ,422glucanase K ORRIG AN in cell elongation and cellulose synthesis in Arabidopsis theliana . Plant and Cell Physiology , 2001,42(3 :251263 15Danieil H , Dhingra A. Multigene engineering :dawnof an exciting new era in biotechnology. Plant Biotechnology , 2002,13:136141 1

35、6Surekha K atiyar 2Agarwal , K apoor A , G rover A. Binary cloning vectors for efficient genetic trans formation of rice. Current Science , 2002,82(7 :873876 17Lin L , Liu Y G, Xu X P , et al. E fficient linking and trans fer of multiple genes by a multigene assembly and trans formation vector syste

36、m. PNAS ,2003,100(10 :59625967 18S ong J Q , D ong F G, Jas on W , et al. Instability of bacterial artificial chrom os ome clones containing tandem ly repeated DNA sequences. G enome ,2001, 44:463469Progress in Development of Large D NA Fragment Cloning V ectorsFAN Y ing 2lun 1 ZH AO K ai 2jun 1,2(1K ey laboratory of Crop G enetics and , inistry ,China , Institute of Crop Science , Chinese ,Beijing 100081, China ; 2, , Abstract DNA cloning for m olecular biology. Since the first plasmid pSC101was used in cloning ,the ,cloning capacity and trans formation ef