bc邢国振药物安全评价

1、马兜铃酸I和马兜铃酸II肾脏致突变作用比较研究邢国振 栾洋 任进 作者简介：邢国振（1980-），男，博士研究生，研究方向为药物毒理学；任进（1958-），女，研究员，研究方向为药物毒理学。通讯作者 E-mail：jren，Tel2012基金项目：国家973项目（2006CB504701）；国家科技部重大专项“重大新药创制”（2008ZX09305-007 和 2009ZX09501-033）；国家自然科学基金（21077112）(中国科学院上海药物研究所 药物安全性评价研究中心)摘要目的：含马兜铃酸（AA）中药在一定范围内仍被大量使用。AAI和AAII是AA的两个

2、主要成分。目前马兜铃酸肾病（AAN）的研究主要集中于AAI，AAII在其中的作用并不明确，容易被忽视。而AA是较强的致突变原和致癌原，AAI和AAII体内致突变作用强弱关系也不明确，AAII可能在致突变和致癌方面起着更主要的作用。因此本研究应用gpt delta 转基因小鼠比较AAI和AAII肾脏致突变作用，为含AA中药材的临床应用提供参考。方法：AAI和AAII致突变作用比较，实验采用gpt delta 转基因小鼠，AAI和AAII分别给予1 mgkg-1和5 mgkg-1 两个剂量（ig），对照组小鼠给予1%NaHCO3，每周 5 次，连续给药 6 w，第 7 w为表达期，第 8 w 处死

3、，取肾脏检测突变率；AAI/II-DNA加合物形成，实验采用gpt delta 转基因小鼠，设5 mgkg-1 剂量（ig），连续给予2 d，最后 1 次给药 24 h 后处死，取肾脏用LC-MS/MS检测AAI/II-DNA加合物；AAI和AAII组织分布，实验采用1 mg/kg和5 mg/kg两个剂量（ig），利用HPLC检测30 min和60 min小鼠血浆和肾脏中AAI/II原型和还原产物含量。 结果：肾脏AAII-DNA加合物生成量要高于AAI(p0.05)；gpt delta 转基因小鼠肾脏突变率随着AAI和AAII剂量增加而增高（p0.05）。相同剂量下，AAII引起的肾脏突变率

4、高于AAI；在5 mgkg-1 时，AAII引起的肾脏突变率明显高于AAI（p0.05）；AAI和AAII 组织分布，1 mgkg-1：AAII血浆浓度，肾脏浓度在30 min 时是AAI 的7.2倍和35.0倍，60 min时已检测不到AAI；未检测到还原产物马兜铃内酰胺I（ALI）和马兜铃内酰胺II（ALII）。5 mgkg-1：AAII 血浆浓度，肾脏浓度在30 min和60min 时是AAI 的4.4，31.5倍和7.7，8.8倍。ALII的肾脏浓度在30 min和 60 min 时略高于ALI，但统计学无差异。结论：相同剂量下，AAII诱发小鼠肾脏突变率高于AAI，不同的代谢途径造成

5、的组织内浓度不同是AAII引起肾脏突变率高于AAI的主要原因；含AA中药临床应用时要考虑AAII的含量。关键词 马兜铃酸 DNA加合物 致突变 转基因小鼠Comparative Study of Aristolochic Acid I and Aristolochic Acid II in Mutagenesis in Kidney by Using Gpt Delta Transgenic miceGuozhen Xing ,Yang Luan , Jin RenAbstract OBJECTIVE: Chinese traditional medicine contained aristo

6、lochic acid（AA）has been largely used in certain areas. AAI and AAII were the main components of AA and AAI was thought to be the main component that caused AAN, the effects of AAII was not sure. AA was a potent mutagen and carcinogen. So far, it is uncertain that which component could induce higher

7、mutation frequency in vivo. Hence we compare the mutagenesis of AAI and AAII in kidney by using gpt delta transgenic mice and provide information for clinical application of Chinese traditional medicine contained AA. METHODS: In the comparetive study of AAI and AAII in mutagenesis, groups of four gp

8、t delta trangenic mice(five heads for vehicle control group) were gavaged with 0, 1 and 5 mgkg-1 of AAI and AAII five times per week for 6 weeks and one week as expression duration.The mice were killed by cervical dislocation 7 days after the final treatment. The kidney was removed and detected the

9、mutagenesis. In the formation of AA-DNA adducts, groups of six gpt delta trangenic mice were gavaged with 5 mgkg-1 of AAI and AAII daily for 2 days and were killed in day 3. The kidney was removed and the concentration of AA-DNA adducts was detected by LC-MS/MS.To detect the distribution of AAI and

10、AAII in plasma and kidney in 30 and 60 minutes by HPLC. RESULTS: The concentrition of DNA adducts formed by AAII was higher than that formed by AAI(p0.05).The mutation frequencies in kidney induced by AAI and AAII were greatly higher than vehicle control(p0.05). The mutation frequency in kidney indu

11、ced by AAII were higher than that induced by AAI in equal dose groups(p95%；脱氧腺苷（dA），脱氧鸟苷（dG），Dnase I，磷酸二酯酶 I，上海生工；甲醇，乙腈为HPLC纯，德国Merk公司；锌粉，上海化学试剂公司；水，MiniQ超纯水（18.2 M）；其它试剂均购于上海国药集团。1.1.1 AAII制备取AAI/II的混合物100 mg，氯仿、甲醇混合溶剂超声混悬，混悬液中加入0.5 g 聚酰胺（100-200目）拌样、干燥，取50g聚酰胺（100-200目）以水为溶剂装柱，柱直径 5 cm，高18 cm，洗脱剂为

12、1：4：0.25的水-甲醇-甲酸溶液，每15 ml收集一个馏分，旋蒸后聚酰胺薄层检测，薄层条件为水-甲醇-甲酸（1：8：0.75），展开后紫外灯365 nm下观察，1-20馏分以AAII为主，下面有少量AAI斑点，合并后采用Sephadex LH-20色谱分离，以水装柱，柱直径1.5 cm，高30 cm，洗脱剂为30%甲醇水溶液，上样前溶液浓缩并在浓缩液中加入数滴吡啶使其澄清。每15 ml收集一个馏分，旋蒸后采用与前述相同薄层条件检测，合并只有AAII的馏分，得到纯品17 mg，纯度大于90%。1.1.2马兜铃内酰胺II制备取AAII约10mg，500mg锌粉，投入50mL 0.05M K3P

13、O4缓冲液（pH 5.8）中，37油浴，搅拌48 h。反应之后用60 mL 乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液减压蒸发干燥，3 mL四氢呋喃溶解，滤过，用制备液相分离ALII。制备液相为岛津LC-6AD，X-Bridge C18反相制备柱，5m，10250 mm，分离条件为90%甲醇等度洗脱。共得马兜铃内酰胺II（Aristolactam II，ALII）1.27 mg，纯度大于95%。1.2 AA-DNA加合物合成1.2.1合成dA-AAI，dA-AAII，dG-AAI，dG-AAII：向500 L 0.05 M K3PO4缓冲液（pH 5.8）中加入AAI/II 0.5 mg，锌粉，10 mg，

14、dN（dA/dG）1 mg，混匀，置37水浴中避光反应16 h以上。取出后用500L乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液氮气吹干，用200L甲醇溶解。稀释100倍后进行LC-MS/MS检测。dA-AAI，M+H+为543，二级质谱碎片离子峰位为427；dG-AAI，M+H+为559，二级质谱碎片离子峰位为443；dA-AAII，M+H+为513，二级质谱碎片离子峰位为397；dG-AAII，M+H+为529，二级质谱碎片离子峰位为413。AA-DNA加合物的二级质谱均是以脱去一个116中性碎片为特征。1.2.2合成5-TTTTTAAAITTTT定制TTTTTATTTT 10 OD，305g。用 2 m

15、L 0.05M K3PO4缓冲液（pH 5.8）溶解，向其中加入AAI 1 mg，锌粉200 mg。37避光搅拌16 h以上。离心取上清制备液相分离。液相条件：X-Bridge C18反相制备柱，5m，10150mm。A：乙腈；B：50mM三乙胺乙酸胺，pH 7.0。洗脱条件：030min，90%B70%B；3135min，70%B90%B，流量为3 mLmin-1。通过光谱学特征，可以确定分离出来的寡核苷酸即是5-TTTTTAAAITTTT（30.3gmL-1），共分得6.36g，产率为2.09 %。1.3 动物分组和处理1.3.1 AAI和AAII致突变作用比较取gpt delta 转基因

16、小鼠，21只，212g，随机分成5组：溶剂对照组，AAI 1 mgkg-1组，AAII 1 mgkg-1组，AAI 5 mgkg-1，AAII 5 mgkg-1组。溶剂对照组 5 只，其余每组 4 只。AAI和AAII给药时用1%NaHCO3溶解。对照组给予1%NaHCO3（ig），其余各组给予相应浓度的受试物（ig），连续给予 6w，每天1次，第 7w 为表达期，于第 8w 处死小鼠，眼底球后静脉丛采血，取肾脏迅速放入液氮中冷冻，然后置于-70深冻冰箱中保存。1.3.2 AAI和AAII DNA加合物形成比较取gpt delta 转基因小鼠，10只，212g，随机分成2组：AAI 5 mgk

17、g-1；AAII 5 mgkg-1，每组5只。分别给予AAI和AAII，连续2 d，24h后处死小鼠，眼底球后静脉丛采血，取肾脏于-40冰箱中保存。1.4 突变分析DNA提取：取约20mg肾组织，用Statagene的RecoverEase(tm) DNA Isolation Kit提取DNA，然后将提取的DNA放入4冰箱中保存。体外包装：用Statagene的Tanspack packaging extract包装噬菌体。取8L DNA加入红管中，上下捣2030次混匀，放入37温箱中孵育1.5 h。取12L蓝管包装液加入红管中，上下捣20次左右，放入37温箱中孵育1.5 h。取出后加入270

18、L SM buffer，涡旋混匀，放入4冰箱中保存。包装效率检测（Packaging effiency）：取2L 噬菌体包装液加入198L SM buffer，混匀。取5L 噬菌体稀释液加入OD600=2.0的XL-1 blue MRA菌液中，放入37温箱中孵育20 min。向每管中加入2.5mL顶层培养基，涡旋混匀后铺到9 cm底层平板中。将铺好的平板倒置于37培养箱中培养1216 h。每个样品2块平板。样品包装效率=每板平均噬菌斑数6000（稀释系数）存活率检测（Titeration）：取2L 噬菌体包装液加入198L SM buffer，混匀。取10L 噬菌体稀释液加入OD600=2.0

19、的YG6020菌液中，放入37温箱中孵育20 min。取出放入37摇床300 rpm 摇菌30 min。向每管中加入2.5mL 顶层培养基，涡旋混匀后铺到9 cm氯霉素（Cm）底层平板中。将铺好的平板倒置于37培养箱中培养72 h。每个样品 2 块平板。样品存活率=平均每板细菌数3000（稀释系数）突变子检测（Mutant）：取60L 噬菌体稀释液加入OD600=2.0的YG6020菌液中，放入37温箱中孵育20 min。取出放入37摇床300 rpm 摇菌30 min。向每管中加入2.5mL 含有6-TG顶层培养基，涡旋混匀后铺到9 cm（Cm+6-TG）底层平板中。将铺好的平板倒置于37培

20、养箱中培养72h+24h（有的突变菌株需要再培养24 h才能形成较为明显的菌落）。每个样品5块平板。突变子确认（Confirmation）：挑取6-TG平板上生长的突变菌落在1/15 Na-K buffer中混合后在Cm+6-TG平板上划板。倒置于37培养箱中培养72 h。确认后的突变菌落数则为整个样品的突变菌落数。突变率=样品确认后的突变菌落数/样品存活率1.5 组织内AA-DNA加合物检测用酚氯仿抽提肾脏DNA。取100g DNA，加入Dnase I 15L（20mgmL-1），35L 10 mM MgCl2 和10 mM Tris buffer，用10 mM Tris buffer 补体

21、积至200L。37孵育2 h后向酶解体系中加入197L 0.2M Tris和2L磷酸二酯酶I（100mUL-1）孵育24 h后向体系中加入1.3L 碱性磷酸酶（1.25UL-1）。孵育24 h 后混匀，取10L加入990L 三蒸水，检测脱氧核苷（dN）含量。剩余溶液用500L乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，氮气吹干，加入100L甲醇溶解，用LC-MS/MS检测AA-DNA加合物。用酶解消化得到的标准dA-AAI定量样本组织DNA中的AA-DNA加合物含量，用dA定量dN（dA，dG，dC和dT）含量。AA-DNA加合物浓度以每107正常脱氧核苷（dN）中的加合物数量表示：AA-DNA= AA-D

22、NA加合物/dN10-71.6 AAI和AAII组织分布取gpt delta 转基因小鼠，2022g，16只，随机分成4组：AAI 5 mgkg-1组；AAI 1 mgkg-1组；AAII 5 mgkg-1组；AAII 1 mgkg-1组。给予AAI和AAII后（ig）30 min，60 min取血，取肾脏。检测血浆中AAI和AAII：4,000g，离心10 min，取血浆，然后1：1加入乙腈混匀，14,000g 离心20 min，然后放入-40冰箱中过夜。次日取出室温放置6 h，14,000g 离心20 min，取上清HPLC分析。检测肾脏中AAI和AAII：称重，按照1mLg-1组织加入生

23、理盐水，匀浆。14,000g 离心10 min 。取上清，然后1：1加入乙腈混匀，14,000g 离心20 min，然后放入-40冰箱中过夜。次日取出室温放置6 h，14,000g 离心20 min，取上清进行HPLC分析。1.7 统计方法 实验数据以S表示，用SPSS 16.0 进行方差分析，P0.05认为有统计学差异。2 结果2.1 AA-DNA加合物特征通过锌粉还原后，AAI和AAII可以被还原生成环外正氮离子与dA和dG的环外氨基结合生成AA-DNA加合物。与文献报道一致，4种AA-DNA加合物在二级质谱均表现出脱去116中性碎片这一特征15。通过锌粉还原，制备液相分离后得到了只有一个

24、核苷酸发生加合的寡核苷酸5-TTTTTAAAITTTT。与文献报道一致，5-TTTTTAAAITTTT的紫外光谱与5-TTTTTATTTT相似，只是5-TTTTTAAAITTTT在320和360 nm下有特征吸收10。图 1 AA-DNA加合物标准.通过锌粉还原方法合成AA-DNA加合物。A：提取的dA-AAI离子色谱峰，二级质谱的M+H+为427伴随着脱去1个116的脱氧核糖中性碎片；B：提取的dG-AAI离子色谱峰，二级质谱的M+H+为443伴随着脱去1个116的脱氧核糖中性碎片；C：提取的dA-AAII离子色谱峰，二级质谱的M+H+为397伴随着脱去1个116的脱氧核糖中性碎片；D：提取

25、的dG-AAII离子色谱峰，二级质谱的M+H+为413伴随着脱去1个116的脱氧核糖中性碎片；E：10-mer寡核苷酸HPLC分离图；F：正常10-mer寡核苷酸和AAI修饰后的10-mer寡核苷酸的紫外吸收光谱。Fig.1 Standard of AA-DNA adducts. The synthesis of AA-DNA adducts was by zinc reduction. A :Extracted ion chromatograms of dA-AAI, The characteristic Fragment ion at m/z M+H+ was 427 with the l

26、oss of 116 Da neutral loss of deoxyriobose moiety; B: Extracted ion chromatograms of dG-AAI, The characteristic Fragment ion at m/z M+H+ was 443 with a the loss of 116 Da neutral loss of deoxyriobose moiety; C: Extracted ion chromatograms of dA-AAII, The characteristic Fragment ion at m/z M+H+ was 3

27、97 with a the loss of 116 Da neutral loss of deoxyriobose moiety; D:Extracted ion chromatograms of dG-AAII, The characteristic Fragment ion at m/z M+H+ was 413 with a the loss of 116 Da neutral loss of deoxyriobose moiety;E: HPLC resolution of 10-mer oligodeoxynucleotides containing a single dA-AA I

28、;F:UV absorbance spectra of dA-AA I in modified and unmodified oligodeoxynucleotides.2.2 AA在肾脏中DNA加合物形成比较利用LC-ESI-MS/MS方法检测AAI和AAII在gpt delta 转基因小鼠肾脏生成的AA-DNA加合物。本研究在肾脏中检测到了dA-AAI，dA-AAII，dG-AAI和dG-AAII 4种加合物。他们的生成量分别为dA-AAI，43.9815.2710-7；dG-AAI， 17.564.1810-7；dA-AAII，130.0055.8210-7；dG-AAII，26.729

29、.5910-7。相同剂量下，AAII生成DNA加合物的总量是AAI的2.5倍（p10）。所有的样本均在线性范围内。A：肾脏dA-AAI，dG-AAI，dA-AAII和dG-AAII生成量对比；B：肾脏AAI生成DNA加合物总量和AAII生成DNA加合物总量的对比。N=5。Fig. 2 Formation of AA-DNA adducts in gpt delta transgenic mice treated with AAI and AAII. AAI-DNA adducts and AAII-DNA adducts were detected in kidney by using LC-

30、ESI-MS-MS.We used dA-AAI as a external standard and the determination limit was 1.8 pmol (y=7.45e-006x2+ 0.00629x+7.9e-005,S/N10).All the samples were within the linearity range.A:Comparison of concentration of dA-AAI,dG-AAI,dA-AAII, dG-AAII; B: comparison of total DNA adducts formed by AAI and AAII

31、 in kidney.N=5.2.3 AA诱发的肾脏突变率比较对照组gpt delta 转基因小鼠突变率为2.371.1410-6。与对照比较，AAI和AAII随着剂量增加肾脏突变率显著增高（p0.05）。不同剂量下，AAII诱发的突变率要高于AAI诱发的突变率，且在5 mgkg-1剂量下具有显著性（p0.05）。图 3 AAI和AAII引起的肾脏突变率比较.溶剂对照组的突变率为2.37 1.1410-6，AAI 1mgkg-1为6.672.3310-6，AAI 5 mgkg-1为16.721.4910-6，AAII 1 mgkg-1为9.544.8410-6，AAII 5 mgkg-1为32

32、.008.9010-6。溶剂对照组，n=5，其它各组，n=4。Fig. 3 Mutation frequency induced by AAI and AAII in kidney.The mutation frequency in Vehicle control group is 2.37 1.1410-6, AAI 1mgkg-1was6.672.3310-6, AAI 5 mgkg-1 was 16.721.4910-6, AAII 1 mgkg-1was 9.544.8410-6, AAII 5 mgkg-1 was 32.008.9010-6.Vehicle control grou

33、p，n=5，other groups，n=4.2.4 AAI 和AAII组织分布30 min和60 min时，AAI和AAII在血浆、肾脏中的浓度差异较大。30 min时，AAII 1 mgkg-1 血浆浓度是AAI 1 mgkg-1的7.2倍，AAII 5 mgkg-1的血浆浓度是AAI的4.4倍；AAII 1 mgkg-1 肾脏浓度是AAI 1 mgkg-1的35.0倍，AAII 5 mgkg-1的肾脏浓度是AAI的31.5倍；1 mgkg-1时在肾脏检测不到ALII和ALI，5 mgkg-1时肾脏ALII的浓度略高于AAI 5 mgkg-1ALI的浓度，但无统计学差异。60 min时，A

34、AI 1 mgkg-1在血浆中已检测不到，AAII 5 mgkg-1的血浆浓度是AAI的7.7倍；AAI 1 mgkg-1在肾脏中已检测不到，AAII 5 mgkg-1的在肾脏的浓度是AAI的8.8倍；ALII和ALI 1 mgkg-1时在肾脏检测不到，AAII 5 mgkg-1肾脏ALII的浓度与AAI 5 mgkg-1ALI浓度相当。结果显示AAII血浆和肾脏中的浓度均明显高于AAI。图 4 AAI和AAII及其代谢产物在 30 min和 60 min时血浆和肾脏中的分布. A：30min时AAI和AAII在血浆中的分布；B：60min时AAI和AAII在血浆中的分布；C：30min时AA

35、I和AAII在肾脏中的分布；D：60min时AAI和AAII在肾脏中的分布；E：30min时ALI和ALII在肾脏中的分布；F：60min时ALI和ALII在肾脏中的分布；N=4。ND，未检测到。Fig.4 Distribution of parent chemicals and their metabolites of AAI and AAII in 30 min and 60 min. A:Concentration of AAI and AAII in plasma(30min); B: Concentration of AAI and AAII in plasma(60min);C:

36、Concentration of AAI and AAII in Kidney(30min) D: Concentration of AAI and AAII in kidney(60min) E: Concentration of ALI and ALII in kidney(30min); F:Concentration of ALI and ALII in kidney(60min) N=4. ND, not detectable.3 讨论和结论本研究表明，肾脏AAII-DNA加合物生成量要高于AAI（p0.05）。gpt delta 转基因小鼠肾脏突变率随着AAI和AAII剂量增加而增

37、高。相同剂量下，AAII引起的肾脏突变率高于AAI。在5 mgkg-1时，AAII引起的肾脏突变率显著高于AAI（p0.05），说明组织内同等浓度的AAI生成ALI的量可能要大于AAII。ALI和ALII可能边生成边消除，不适于用来反映形成环外正氮离子总量。AA-DNA加合物是AA生成环外正氮离子后与DNA共价结合后的直接产物，而且ALI和ALII消除的速度快于DNA加合物消除速度，因此AA-DNA加合物的生成量更好的反映了AA进入机体后形成环外正氮离子的量。研究结果显示给药24 h后的AAII-DNA加合物明显高于AAI-DNA加合物（p0.05），与AAII和AAI在肾脏诱发的突变率的趋势

38、相一致，因此用AA-DNA加合物来表示形成环外正氮离子的量更符合实际情况。在不考虑机体对其处置因素的情况下，AAI的致突变能力可能强于AAII。但由于体内过程不同，使得在相同剂量下AAII引起肾脏突变率明显高于AAI。AAI和AAII在人体内主要形成内酰胺产物，O-脱甲基产物AAIa生成量较小23。但多项代谢研究表明，人肝微粒体和重组的CYP1A1/2均能够代谢AAI生成AAIa17, 21。AAI和AAII在啮齿动物体内过程可能与人体内相近，AAII对人的致突变作用和致癌作用可能要强于AAI。由于AAI是引起AAN的主要致病因素，而AAII几乎无作用，所以在临床应用的过程中可能会忽视AAII

39、的致突变和致癌作用，造成不良后果。因此临床上对含AA中药既要同时检测AAI和AAII，还要根据情况进行有目的的应用。综上所述，AAII在小鼠肾脏的致突变能力高于AAI。不同的代谢途径造成的组织内浓度不同是AAII肾脏突变率高于AAI的主要原因。本研究为含AA中药的临床应用提供一定的参考。参考文献1.Debelle, F.D., J.L. Vanherweghem, and J.L. Nortier, Aristolochic acid nephropathy: a worldwide problem. Kidney Int, 2008. 74(2): 158-69.2.Stefanovic,

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