去氢骆驼蓬碱(Harmine)增敏Bcl-2抑制剂抗非小细胞肺癌的作用及机制研究

1、去氢骆驼蓬碱(Harmine)增敏Bcl-2抑制剂抗非小细胞肺癌的作用及机制研究目的：化疗是目前非小细胞肺癌(NSCLC晚期主要治疗手段,而月中瘤耐药是造成化疗疗效不佳的主要原因。大量研究发现,抗凋亡蛋白Bcl-2表达的升高与NSCLCt疗耐受以及不良的预后有关，Bcl-2蛋白小分子抑制剂为目前抗月中瘤药物的研究新方向。然而Mcl-1的高表达往往引起Bcl-2抑制剂(ABT-199/ABT-737)的实体瘤耐药。Harmine是DYRK1徽酶的才制剂，具有抗月中瘤增殖和诱导月中瘤细胞凋亡的作用。本研究旨在探讨Harmine增敏Bcl-2抑制剂抗NSCLCS性彳用,以及其下调Mcl-1蛋白表达的

2、具体分子机制,为拓展两药的临床抗实体瘤应用提供理论基础和实验数据。方法：SRB法考察Harmine、ABT-199/ABT-737单用或合用对NSCLC细胞(A549、NCI-H46RNCI-H1299和Primary1#、Primary2#、Primary3#和Primary4#)的增殖抑制作用；集落形成实验检测合用对NSCLCffl胞增殖的影响；显微镜下观察各药物组处理后的细胞形态的改变;流式细胞术检测Harmine及Bcl-2抑制剂单用或合用对肿瘤细胞凋亡的影响;WesternBlotting检测Cleaved-PARP、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、DYRK1

3、、AMcl-1、Bcl-2和Bcl-xl等相关蛋白的表达；利用质粒转染法扩增目标蛋白(Mcl-1)的表达;RT-PCR检测siDYRK1A或Harmine给药处理后对DYRK1AiMcl-1mRNA*平的影响；利用siRNAg术沉默DYRK1AM表达。结果:SRB法显示Harmine在体外能显著增敏Bcl-2抑制剂抗NSCLCffl胞增殖,Harmine与ABT-199联用在A549NCI-H460和NCI-H1299细胞中的平均CI值分别为0.80,0.85和0.68,Harmine与ABT-737合用在三株细胞中的平均CI值分别为0.87,0.77和0.61;在原代NSCLC田胞中也具有很

4、好的合用效果,Harmine与ABT-199联用在Primary1#、Primary2#、Primary3掰口Primary4#细胞中的平均CI值分别为0.81,0.86,0.85和0.84,Harmine与ABT-737联用在四株原代NSCLCffl胞中白平均CI值分别为0.73,0.87,0.67和0.81。因此Harmine与Bcl-2抑制剂合用具有较好的协同抑制NSCLCffl胞增殖的效果。采用细胞克隆实验，我们发现合用组相对于单用组对NSCLC田胞的的克隆抑制能力明显增强;同时Harmine与Bcl-2抑制剂联合用药能协同诱导A549、NCI-H460和Primary3#细胞凋亡，伴

5、随着Caspase-3和PARP勺激活，在A549细胞株上，药物作用48h后,Harmine单用组凋亡率为21.4010.04%,ABT-199单用组凋亡率为34.051.91%,ABT-737单用组凋亡率为31.000.28%,而合用组凋亡率分别达到86.053.18%?口76.551.20%,在NCI-H460细胞株上,Harmine单用组凋亡率为38.557.00%,ABT-199单用组凋亡率为19.250.35%,ABT-737单用组凋亡率为10.400.42%,而合用组凋亡率分别达到77.108.63%和72.5513.51%,Primary3#细胞经Harmine(5mMABT-1

6、99(5mM处理后凋亡率为14.80%,35.8%,而合用组凋亡率达到52.7%;Harmine与Bcl-2抑制剂联合用药能促进Mcl-1蛋白的下调；过表达Mcl-1能减弱ABT-199的增殖抑制作用，当2.5mM的ABT-737处理时对照组的存活率为18.830.92%,而pTOPO-Mcl-1质粒转染后的Primary3#的存活率为49.462.21%,相比于对照组,相比于对照组,高表达Mcl-1的Primary3#细胞存活率明显较高;Harmine能促进NSCLC田月MMcl-1蛋白的降解，从而显著下调Mcl-1蛋白表达水平;通过siRNA敲低DYRK1Ag下调NSCLCMfiMcl-1蛋白水平；过表达DYRK1雁减弱Bcl-2抑制剂抗NSCLC