重编程及诱导性多能干细胞在再生医学的研究进展

1、·综述·重编程及诱导性多能干细胞在再生医学的研究进展刘路韦曦凌均棨细胞分化是由多种特定的分化基因网络相互作用、共同调控完成的生物学过程,如骨髓间充质细胞矿化,是在TGF/BMP、Wnt、Notch和Cadherin等信号通路协同作用下,先分化为成骨细胞,随后矿化完成的1。在一定条件下该程序可逆向编程,称为细胞重编程(reprogramming或去分化(de-differentiation2-3。由于胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs的应用面临伦理及免疫排斥等问题4,而将体细胞去分化为多能性干细胞,不仅可弥补ESCs 的不足,而且符合法律和伦理规范

2、,因此具有广阔的应用前景,是当前干细胞组织工程学和再生医学研究的最前沿5-6。近年来,在干细胞组织工程学领域出现了较大的突破和进展,但许多问题仍然未得到解答,如已分化细胞重编程为更早期更原始细胞的能力,干细胞微环境对分化、转分化、重编程的作用和影响,分化、转分化和重编程的关系等7。由于其复杂性,分化及再生中涉及的分子调控机制尚不清楚,使对该生物学行为的认识以及干细胞治疗的临床应用受到了限制。一、转分化和去分化较早的研究认为,只有未分化状态的细胞具备多向分化潜能,而部分或完全分化细胞不具备该功能8。然而,去分化、转分化(transdifferentiation、可塑性(plasticity概念的

3、提出打破了这一传统观念。去分化是分化的细胞类型转化为另一较原始的具备更多分化潜能的细胞类型,分化的细胞状态转化为类似胚胎干细胞或前体细胞的状态9-10。转分化最初定义为已分化细胞通过出生后的细胞核基因编程转化为另一分化的细胞类型的不可逆的过程11。随后,转分化概念被用于描述单功能分化的细胞类型转化为可分化为多细胞器官的多种细胞类型,以及组织特异性干细胞跨胚层分化的过程3。转分化属于广义的细胞类型转换(metaplasias,是一种由核心调控基因(master switch gene表达改变而引起的细胞形态和性能改变。可塑性指成体干细胞不仅可以生成它们所在组织的成熟细胞,而且在特定环境下能跨系或

4、跨胚层转化成其他组织类型细胞的能力,如基因标记的骨骼肌细胞和神经干细胞可在一定条件下分化为造血干细胞12。尽管存在争议,许多关于低等脊椎动物的报道表明转分化和去分化在自然界中绝非偶然现象13-14。转分化和去分化涉及数个关键基因及其网络的调控,对该分子机制的研究有助于进一步认识细胞的发育生物学,为干细胞治疗的应用提供理论依据。然而,鉴定转分化和去分化的金标准;转分化的细胞转换是否首先通过细胞去分化,回到一个较原始的状态,再向另一方向分化11;转分化和去分化是否由相似的分子机制和不同程度的细胞核重编程完成,该过程是否为时空依赖性的生物学过程,受表达的基因和元件协同网络调控15等问题尚待探讨。基金

5、项目:国家自然科学基金(30872876;广东省科技计划项目(2008B030301075作者单位:510055广州,中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院·口腔医学研究所二、重编程及诱导性多能干细胞ESCs具备良好的干细胞潜能,但越来越多的研究表明ESCs涉及难以解决的伦理、免疫排斥等问题。相对而言,众多器官来源的成体干细胞易于获得,不存在免疫排斥,逐渐成为细胞替代治疗的研究热点和种子细胞的来源。然而,大多数成体干细胞自我增殖和多向分化能力有限,且多为异质性细胞群,干细胞比例极低,作为种子细胞应用的可能性受到限制16,因此诱导成人体细胞成为多能干细胞将提供有效的解决途径。2

6、006年,Takahashi等2将从ESCs中筛选获得的24个候选基因分别插入逆转录病毒载体,感染小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF,揭示Oct-4、Sox-2、c-m yc、Klf4四种基因组合转染的MEF具备与ESCs相似的细胞形态、表面标记、自我增殖和多向分化能力,从而将转染细胞命名为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS。随后,Yu 等17通过整合14个重编程候选重组基因入人类体细胞,证实Oct-4、Sox-2、Nanog及Lin28在重编程及iPS细胞形成中的作用最为突出,其中Oct-4和S

7、ox-2直接影响iPS细胞克隆形成,而Nanog及Lin28则可协助Oct-4/Sox-2作用,提高克隆形成率和iPS细胞存活率。重编程及诱导性多能干细胞是干细胞领域的重大发现,对解决种子细胞来源稀少的问题具有重要意义。然而,对于重编程及诱导性多能干细胞的认识还停留在初级阶段,其具体调控机制、信号通路、与微环境的关系以及iPS在体内的成瘤性等问题尚未解决,且人工诱导iPS细胞的方法及效率均有待提高6,18。ESCs全能性相关转录因子Oct-4蛋白由octamer连接转录因子4基因(Oct4、Oct3/4、Pou5F1编码,属于POU家族成员,是诱导、维持细胞多能性及未分化状态的主要调节因子19

8、。大量研究发现,Oct-4在维持ESCs多能性和重编程iPS细胞的基因调控网络中具备重要作用,其表达的丧失可导致多能性的丧失、细胞分化及iPS细胞克隆形成能力的丧失2,17,20。随后研究揭示人类Oct4两个亚型呈现不同的表达模式,并在维持自我更新和多向分化潜能方面具备不同的功能21。Oct4A亚型位于细胞核内,与维持干细胞性能和转录因子功能相关;而Oct4B主要表达于细胞质,对干细胞功能的维持未证实有明显相关作用。此外,自我更新和胚胎干细胞系标记Sox2(Sex determining region Y bos-2也被报道在诱导多能干细胞和胚胎干细胞中具备不可或缺的关键作用6-7。Sox-2

9、是SRY相关HMG盒转录因子家族成员,在早期胚胎发育中与Oct-4呈现相关的表达模式并协同调控早期胚胎发育相关基因的表达22。通过RNA干扰敲除Sox2可与Wnt信号通路核心元件-catenin反应,使Wnt通路靶基因CCND1和c-m yc下调,从而抑制矿化23。Oct4和Sox2可共同作用启动多种转录因子(如c-m yc、Klf4、FGF4和Nanog的表达,调控细胞多能性,提示了Oct4-Sox2复合体在细胞分化和重编程基因调控网络中的核心地位。有学者提出,在人类和小鼠胚胎干细胞中Sox2均为Oct4的靶基因,直接受Oct4调控24。然而,近年研究提出Oct4对骨髓细胞和组织来源成体细胞

10、多能性的维持并非不可缺少25,Sox2在成人体细胞重编程的过程中具备独立的作用,甚至可影响Oct4的表达26。三、重编程在口腔再生医学的研究现状在口腔干细胞组织工程和再生医学领域,关于诱导性多能干细胞重编程核心调控因子的研究尚属起步阶段。2006年,Kerkis等27从脱落乳牙中分离到表达Oct-4、Nanog、SSEA-3、SSEA-4等胚胎干细胞标志的牙髓干细胞。Cheng等28亦报道成年猩猩的牙髓组织中含有Oct-4、Sox-2、Nanog、Rex-1阳性细胞。此外,Agata等29证实缺氧状态可激活未分化的猪牙髓细胞中Oct-4和Sox-2的瞬间表达,而对已矿化诱导的牙髓细胞无明显作用

11、。Techawattanawisal 等30则发现,体外诱导成体大鼠牙周韧带细胞,可强表达Sox-2和弱表达干细胞标记ABCG2,但不表达Oct-4。四、存在问题及前景展望关于分化这一可逆性过程的研究目前仍存在许多未解答的问题,如在非自然条件下的细胞类型转换是否颠覆了传统的发育和分化理论,细胞重编程及其最终的状态是否由外源性环境信号、细胞内在分子机制抑或两者共同决定31。迄今,我们对组织再生和细胞重编程的分子调控机制知之甚少,转染和细胞核移植是目前认为最有效的诱导体细胞重编程的方法。然而,由于缺乏鉴定iPS的金标准,该作法是完全的重编程抑或细胞融合的假象尚无定论3。在各种成体细胞中,重编程可能

12、存在一个共同的基因调控网络,或许通过组织特异性的网络调控,导致不同组织来源细胞自我更新和多向分化能力。而如何高效的引入关键核心基因调控网络,以确保该基因网络能在各种发育分化等生物学转化过程中发挥稳定作用尚不清楚29。有研究表明,干细胞迁移至新环境可分化为表达该组织特异性标记的细胞,但它们依然无法完全具备该组织来源细胞的所有生物学特性32。有学者提出,组织特异性干细胞在体内存在多潜能状态,该状态由外源性和内源性干细胞微环境信号共同调控,而不是单一由Oct4等几个转录因子调控33。如果这是事实,体内和体外干细胞微环境可能对重编程过程有不同的作用。核心转录因子激活、出生后的基因修饰启动,以及随后的基

13、因表达模式的改变和重编程过程,可能由干细胞微环境启动和诱导。由此可见,分子水平的细胞重编程过程仍需进一步研究,才能为体内实验以及将来的临床应用提供可靠的实验依据。综上所述,细胞重编程及诱导性多能干细胞的发现为解决组织工程中种子细胞来源不足这一难题具有重要意义。虽然诱导性多能干细胞最终的临床应用仍面临许多技术问题,如重编程基因的稳定持续表达、提高转染效率、非病毒载体的应用等,但体细胞重编程为多能干细胞仍可望为再生医学和干细胞治疗全身性疾病提供优质种子细胞,在不久的将来应用于各种老年性相关疾病和损伤修复治疗。参考文献1Lian JB,Stein GS,Javed A,et al.Networks

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