6、基因组不稳定性

1、分子机制研究套路（六）基因组不稳定性课题： A 肿瘤的微卫星不稳定与染色体不稳定研究1概念介绍：微卫星 (microsatellite ,MS) 是由 1-6个核普酸组成， 具有高度多态性的简单串联重复序列，广泛分布于整个基因组 DNA 序列中，复制过程中易于发生改变，人类基因组中最常见的微卫星序列是胞嘧啶和腺嘌呤的二聚体（CA ），尽管微卫星序列在个体之间存在广泛的多态性，但在个体内部保持一定的稳定性，而且能在后代中保持遗传的稳定，因此微卫星序列是重要的遗传标志，可以作为遗传学研究的标志。微卫星不稳定性(MSI) 是这些简单重复序列的改变，MSI 只有在许多细胞都发生同样的改变才能被检测出，

2、是肿瘤细胞克隆性增殖的一个指标。错配修复功能下降会引起DNA 复制错误增加， 导致 MSI ，目前研究表明 MSI 是错配修复基因失活的一个重要表型。MSI 检测的方法较多， 常用的检测方法有变性凝胶电泳、基因扫描、变性高效液相色谱分析等方法。基因扫描法将微卫星位点的PCR 引物在一端进行荧光标记，然后扩增该微卫星位点，将PCR 扩增产物在荧光毛细管中进行电泳，以基因扫描进行分析得出不同条带的碱基数，从而确定其大小， 该方法的敏感性较高， 可以高通量检测微卫星位点。染色体是细胞遗传的物质基础，分子细胞遗传学研究表明大多数肿瘤细胞特别是实体瘤细胞在发生发展的过程中都存在染色体片段的非随机异常，表

3、现为染色体数目或结构的改变，这些改变与原癌基因的扩增和抑癌基因的缺失密切相关。染色体不稳定(CIN) 包括整条染色体的获得或缺失 (非整倍体 ) 、杂合性缺失、 染色体易位、 重排、基因扩增导致的染色体均染区、双微体等。细胞核中DNA 含量直接反映细胞核酸代谢水平和生长增殖活性，正常细胞核DNA 的含量比较稳定，多以二倍体形式出现，肿瘤细胞的DNA 含量增高，多为非整倍体。测定细胞核DNA 的含量可直接反映肿瘤细胞增殖状态，在判断肿瘤的恶性程度及预后方面有重要意义。2研究思路：2.1A 肿瘤的微卫星不稳定（MSI ）研究22.1.1A 肿瘤中 MSI 检出率22.1.2A 肿瘤的 MSI 与临

4、床病理特征的关系32.2A 肿瘤的 DNA 倍体分析32.2.1DNA倍体分析结果32.2.2A 肿瘤的 DNA 倍体分析与临床病理特征的关系32.3 比较基因组杂交（CGH ）研究 A 肿瘤的染色体变异32.3.1CGH分析结果32.3.2 染色体变异数与临床病理特征的关系32.4 染色体变异与DNA 倍体的关系42.5 染色体变异与MSI 的关系42.1 A 肿瘤 的微卫星不稳定（MSI ）研究2.1.1 A 肿瘤 中 MSI 检出率首先需要明确所研究肿瘤类型的微卫星敏感位点MSI-1 和 MSI-2 （例如：单碱基重复序列BA T25 和 BAT26 是检测散发性结直肠癌MSI 高度敏感

5、的位点） ，然后设计引物，并在引物上游或下游标记荧光染料，应用荧光标记多重PCR 法扩增微卫星位点MSI-1 和 MSI-2 ，应用全自动 DNA 测序仪和 Genescan3.1 软件对 A 肿瘤进行 MSI 分析。结果显示： N 例 A 肿瘤患者中， MSI-1 和 MSI-2 两个位点均阳性者例，MSI-H 发生率为% ； MSI-L 发生率为 %，其中 MSI-1 单位点阳性者例，MSI-2 单位点阳性者例；两个位点均阴性者例，MSS 发生率为 %。2.1.2 A 肿瘤 的 MSI 与临床病理特征的关系考察 A 肿瘤 中 MSI-H 、MSI-L 和 MSS 组别在性别、年龄、组织类型

6、、分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移等方面是否有统计学差异。2.2 A 肿瘤 的 DNA倍体 分析2.2.1 DNA倍体 分析结果通过流式细胞仪分析例A 肿瘤 标本中， 二倍体 为例，占 % ；异倍体 为例，比例为 %。2.2.2 A 肿瘤 的 DNA倍体 分析与临床病理特征的关系结果显示， A 肿瘤 的 DNA 倍体 与患者的性别、年龄及组织学类型无明显相关性。低分化癌异倍体 发生率高于高、 中分化癌， 但均未达到统计学差异(P>0.05) 。DNA 倍体 与患者的TNM分期有密切关系，分期越高，异倍体 的比例越高，统计学有显著差异。2.3 比较基因组杂交（ CGH ）研究

7、A 肿瘤 的染色体变异2.3.1 CGH 分析结果在 CGH 检测的例 A 肿瘤中，所有病例均有不同程度的染色体臂发生扩增或丢失 。例 A肿瘤 中共有处染色体臂变化，其中处 扩增和处 丢失。平均每例变异数为， 其中扩增数为，丢失数为，扩增数明显多 /少于丢失数，其比例为。将例A 肿瘤出现染色体异常的性质及区域定位总结于一张CGH 概貌图，常见的染色体 扩增 区域 (>20%) 有 : ，等；常见的染色体丢失 区域 (>20%) 有 : ，等。2.3.2染色体变异数 与临床病理特征的关系TNM 分期中 111、 IV 期 A 肿瘤的染色体总变异数和扩增数、缺失数均高于I、11 期，两

8、者差异有统计学意义。肿瘤部位、组织学类型、分化程度等与染色体总变异数、扩增数和丢失数比较差异均无统计学意义。常见的染色体扩增区域中区域与TNM 分期有关， 111、 IV 期 A 肿瘤 区域扩增数明显高于I 、 11 期，区域、区域和区域与TNM 分期无明显关系。常见缺失区域区域、区域和区域等与A 肿瘤 的临床分期间差异均无统计学意义2.4 染色体变异 与 DNA倍体的关系例二倍体A 肿瘤共有处染色体臂变化，其中处扩增和处缺失，平均每例染色体变异数为，扩增数为，缺失数为。例异倍体MSS 的 A 肿瘤 共有处染色体臂变化，其中处扩增和处缺失，平均每例染色体变异数为，扩增数为， 缺失数为。二倍体与

9、异倍体两者在染色体总变异数及缺失数上有显著差异。二倍体常见的染色体扩增 区域 (>20%) 有 : ，等；二倍体常见的染色体丢失区域 (>20%)有: ，等。异倍体常见的染色体扩增 区域 (>20%) 有 : ，等；异倍体常见的染色体 丢失区域 (>20%) 有 : ，等。2.5 染色体变异 与 MSI 的关系例 MSI-H 的 A 肿瘤共有处染色体臂变化，其中处扩增和处缺失，平均每例染色体变异数为，扩增数为，缺失数为。例MSS 的 A 肿瘤 共有处染色体臂变化，其中处扩增和处缺失，平均每例染色体变异数为，扩增数为，缺失数为。MSI-H与MSS 两者在染色体总变异数及缺失数上