哺乳动物细胞自噬的研究方法

1、哺乳动物细胞自噬的研究方法摘要：细胞自噬参与多种生理和病理过程。因此，科学研究中需要对细胞自噬进行精确识别、定量以及对自噬过程进行操作。然而，因为细胞自噬是动态和复杂的过程，所以对其进行的分析经常是不准确的。在本文中，我们讨论监控细胞自噬和调控细胞自噬活动的方法，尤其关注哺乳动物细胞巨型自噬。前言过去十年，对称之为自噬的细胞基本生物学过程有了“爆炸”性的研究。细胞自噬过程中所必需的进化保守基因的发现（最先在酵母中确认），促使科学家揭示了一系列关于细胞自噬对内环境稳态、发育过程以及其他生理功能的影响。此外，更多的证据提示细胞自噬的异常可以引起很广泛的哺乳动物疾病(Levine and Kroem

2、er, 2008; Mizushima et al., 2008)。因此，科学家就急迫需要对多种多样生物过程中的细胞自噬进行检测及功能研究，尤其是在哺乳动物中。哺乳动物细胞自噬研究历来受两个主要因素的困扰。第一，用静态的检测手段捕获一个动态的过程本身就是一个困难，以及基于这些检测手段的生物学干预的先天性限制。第二，区分形态和功能是另一个挑战，在特定的生理条件下对细胞自噬的研究中，要避免由于检测手段的缺陷将这种生理功能认定为细胞自噬。过去我们对哺乳动物细胞自噬功能的误解主要是以上两种原因导致的。比如，在特定的神经、肌肉退行性疾病中，由于细胞自噬早期中间产物积累增多，似乎代表了细胞自噬通路后期阶段

3、被抑制，这些疾病就被认为或部分被认为是由于细胞自噬增多引起（基于细胞自噬过程中早期中间产物数量的增多）(Levine and Kroemer, 2008; Mizushima et al., 2008; Rubinsztein, 2006)。细胞自噬是一种常见的细胞死亡过程中的形态特征，经常被错误的认定为是一种细胞死亡通路，然而现在可以明确细胞自噬主要功能之一是：在恶劣条件下，细胞自噬使细胞能存活(Kroemer and Levine, 2008)。在阐明细胞自噬分子机制过程的研究中，由于新技术方法的发展和应用，过去研究细胞自噬的部分困难被克服。因此在过去十年里，针对细胞自噬动态过程的观察和在

4、特定细胞过程中研究调控细胞自噬功能的多种新技术应运而生。本文的目的是综述目前研究哺乳动物细胞自噬的各种实用技术以及这些技术在解释细胞自噬中的局限。关于每种技术的具体细节可以参照以下其他综述(Klionsky et al., 2008a; Mizushima, 2004; Mizushima and Yoshimori, 2007; Rubinsztein et al., 2009)。细胞自噬引言细胞自噬是一个描述包括细胞器在内的胞浆物质进入溶酶体而被降解过程的通用术语(Levine and Kroemer, 2008; Mizushima et al., 2008; Rubinsztein,

5、2006)。在巨型自噬、微型自噬和分子伴侣介导型自噬这三种细胞自噬类型中，巨型自噬的研究最为深入。分子伴侣介导型自噬过程中，胞质蛋白借助分子伴侣的蛋白折叠效应直接跨膜进入溶酶体。微型自噬涉及溶酶体膜的内陷，膜的内陷可以使一部分细胞质进入溶酶体。巨型细胞自噬（文中以下部分简称细胞自噬）是本文关注的重点。从酵母到哺乳动物，细胞自噬是一个由自噬体介导的保守过程。起初，被称为独立膜或吞饮泡的小囊泡逐渐延伸并包裹胞浆，最后形成双层膜结构的自噬体（图1和图2）。随后，自噬体的外层膜与溶酶体融合形成自噬溶酶体，介导被包裹物质连同自噬体内层膜的降解。自噬体在于溶酶体结合之前也可以同内涵体融合。由自噬降解产生的

6、氨基酸和其他小分子物质重新运回胞浆中被再利用或产能。以下描述的方法用于检测自噬过程的不同阶段的物质包括早期自噬体、自噬溶酶体和自噬降解产物，我们应该综合应用这些实验方法避免错误的解释实验结果，比如自噬中间产物的增多是否能说明细胞自噬的真正增加，或者自噬最后完成阶段的阻滞（图3和图4）。在生理条件下，细胞自噬具有许多重要作用比如在饥饿状态、胚胎植入前和发育过程中维持氨基酸库的稳定、抑制神经退行性病变、抗衰老、肿瘤抑制、细胞内微生物的清除以及先天固有免疫和后天适应免疫的调节(Cecconi and Levine, 2008; Deretic and Levine, 2009; Levine and

7、 Kroemer, 2008; Mizushima et al., 2008; Rubinsztein, 2006) 。细胞自噬特征之一是它的动态调节；在基础状态下，细胞自噬水平很低，但是自噬可以被很多刺激因素明显激活。无论是从酵母到哺乳动物的培养细胞还是完整的有机体，细胞自噬最常见的诱导因素是营养饥饿。除了饥饿激活细胞自噬外，激活细胞自噬的因素还包括其他生理性应激刺激（缺氧、能量消耗、内质网应激、高温和高密度环境）、激素刺激、药物刺激（雷帕霉素等其他化合物）、固有免疫信号分子和疾病包括细菌、病毒、寄生虫感染、急性胰腺炎、心脏病和蛋白沉积。相反，细胞自噬的抑制也往往与特定疾病相联系，包括癌症的

8、亚型、部分神经退行性疾病和感染性疾病以及炎症性肠道疾病，细胞自噬功能降低是衰老的共同特征。由于细胞自噬与多种生理和病理过程相联系，细胞自噬研究中就需要更多的科学方法来确定（1）在特定的生物环境下细胞自噬是否存在、上调或抑制；（2）细胞基础自噬和/或修饰自噬是否参与并如何调节特定的生理或病理过程。细胞自噬涉及一系列进化保守基因产物的参与，比如独立膜和自噬体形成所需要的Atg蛋白（表1）。自噬体形成分为两个主要步骤：独立膜成核阶段和延伸阶段。ULK/Atg1激酶复合物、自噬特异性PI3K激酶复合物和PI3P效应物以及同它们相关的蛋白在成核阶段起着重要作用，而Atg12-LC3/Atg8偶联系统在延

9、伸阶段起着重要作用。此外，自噬体与溶酶体融合过程、溶酶体的酸化及溶酶体消化过程也需要其他蛋白参与，与自噬相关的具有整合环境因素的调节信号也参与这些过程中。有关自噬分子调节机制的具体细节可参考以下文献(He and Klionsky, 2009; Longatti and Tooze, 2009)。在哺乳动物细胞，大多数Atg蛋白（比如ULK1/2, Atg13, FIP200, Atg101, Beclin 1, Atg14, LC3, Atg12, Atg16L1）分布在独立膜上，在完整的自噬体上Atg蛋白分布较少(Longatti and Tooze, 2009)（图1和表1）。酵母Atg

10、8的哺乳动物同源体微管相关蛋白轻链（LC3）是目前唯一发现存在于自噬体的蛋白，因此LC3蛋白广泛用于作为自噬体的标记物（图1和图4B）(Kabeya et al., 2000; Mizushima et al., 2004)。对细胞自噬过程的认识极大促进细胞自噬的检测（基于LC3的生物化学和显微镜的检测方法），同样也使对细胞自噬过程的操作成为可能（通过敲出或降低自噬基因的表达或者主要的自噬抑制蛋白基因的表达）。利用化学物质干预自噬体形成或下游的降解过程也使一种操作细胞自噬过程的方法（图1）。检测细胞自噬活动细胞内自噬体数量增多总是说明细胞自噬活动增加是一个普遍存在的错误概念。因为自噬体是动态过

11、程中的中间产物，所以在任何特定时间观察到的自噬体数量是代表自噬体产生效率和它们转变为自噬溶酶体效率之间的平衡。这样以来，自噬体的积累增多可能代表自噬活动被诱导，或者相反是由于自噬体形成的下游被阻断引起自噬体增多。比如，相对于基础水平的细胞自噬（图3A），细胞自噬激活后可以导致所有自噬中间产物的增多包括独立膜、自噬体和自噬溶酶体（图3B）。如果自噬体形成过程中的上游某个步骤被阻断，那么所有自噬中间结构产物的数量就会降低（图3C）。相反，当自噬体形成过程中的下游某个步骤被阻断，自噬结构的中间产物数量就会增多，而自噬溶酶体数量就会减少（图3D）。很明显，在这两个截然相反的情况下，自噬的激活（即增加自

12、噬性降解）（图3B）和自噬过程下游被阻断（即减少自噬性降解）（图3D）都可引起自噬体数量增多。因此，简单的自噬体数量多少检测还不足以对自噬活动进行评估。甚者，应该利用不同的方法共同区分基础水平自噬、诱导性自噬、自噬上游水平的抑制和自噬下游水平的抑制。细胞自噬流是一个用来描述自噬体形成的动态过程、向溶酶体转移自噬性物质以及自噬性物质在溶酶体降解过程的术语。自噬流是显示细胞自噬活动的指标，比测定自噬体数量更为可靠。以下章节，我们讨论检测细胞自噬体数量和细胞自噬流的各种不同方法。自噬体数量检测目前，主要有三种方法用来定量检测自噬体数量，包括电子显微镜和光学显微镜检测LC3亚细胞定位，生物化学方法检测

13、与自噬体膜相关的LC3。电子显微镜电子显微镜是最常用的研究方法，事实上哺乳动物细胞自噬就是1950年后期电子显微镜工作者研究溶酶体过程中发现的。在超微机构水平，自噬体被定义为是一个双层膜机构包裹着未被消化的胞浆物质，该双层膜结构没有与溶酶体融合（图2和图4A）。自噬体中经常包涵诸如线粒体和内质网碎片在内的细胞器。根据自噬体明确的定义，识别自噬体识别就很容易，因为这些细胞器包涵细胞内物质。然而，如何解释双层膜结构特异包裹细胞内病原体不是很清楚：一些病原体的生命周期经过了自噬样中间结构的转化，而最终没有进入溶酶体；在其他一些情况下，细胞内病原体进入自噬通路被溶酶体降解。自噬体传统经典定义也包括双层

14、膜结构所包含的不同细胞内容物。这些都是巨型细胞自噬过程所描述的事情，然而还存在着细胞器特异性自噬比如过氧化物酶体自噬、线粒体自噬、核小体自噬和内质网自噬等(van der Vaart et al., 2008)。因为哺乳动物细胞存在病原体特异性和细胞器特异性自噬，与传统的巨型细胞自噬不同，所以必须对基于形态学指标的自噬体检测重新审视。相对于包含细胞内容物的自噬体而言，如何区分自噬溶酶体和具有膜结构的细胞组分经常比较困难。自噬溶酶体是由自噬体和溶酶体（或内涵体）融合而成的细胞器，具有限制性单层膜结构和包含了胞浆物质的不同阶段降解物。在早期，自噬溶酶体内容物可以识别其来源于胞浆，然而当降解比较完全

15、时就很难识别其来源。甚者，自噬溶酶体和细胞内吞结构以及其他来源不清楚的囊泡结构之间的识别也往往很困难。尤其是没有或含有较少内容物的囊泡就不能认为是自噬结构。其他对自噬体错误解释的典型例子见以下综述(Eskelinen, 2008)。尽管电子显微镜是一个强大的工具，但因其在功能研究上的潜在局限性，所以电子显微镜不是完美的研究方法，其功能研究的局限性将在下文讨论。荧光显微镜利用电子显微镜技术评估自噬体要求研究者具备相当多的专业技能，逐渐被光学显微镜和生物化学方法所替代，后两种方法相对于不同领域科研工作者更容易做到。前文提到，哺乳动物自噬蛋白LC3作为自噬体的标记物（图1和图4B）。在四种LC3同源

16、异构体中，LC3B最常被用作标记物。合成开始不久，初始LC3的C末端被Atg4加工变成LC3-I，LC3-I的C末端含有甘氨酸残基。随后，通过泛素样酶促反应LC3-I和磷脂酰乙醇胺（PE）结合变成LC3II（LC3-PE）。LC3-I位于胞浆内，而LC3II位于自噬体外层和内层膜上（图4B）。自噬体与溶酶体融合后，外层膜上的LC3在Atg4裂解作用下离开膜，内层膜上的LC3被溶酶体酶降解，最终导致自噬溶酶体的LC3含量极低。因此，在荧光显微镜下观察到的内源性LC3或GFP偶联的LC3会弥散性分布在胞浆内，这些点状结构主要代表自噬体（图5A）。尽管细胞中的含LC3或GFP-LC3的点状结构数量可

17、以精确测量自噬体的数量，但这种方法有一些不足。首先是存在主观性，研究者需要建立和应用统一的标准来制定定量的方法和对斑块的定性标准。斑块结构的数量可以人工计数（要求计数人对实验条件不清楚）或者用电脑图像分析软件自动计数（Top Hat algorithm of MetaMorph version 7.0 by Molecular Devices, and G-Count by G-Angstrom）。自噬激活后，这些斑块数量会明显增加，然而在正常情况下也会观察到少量斑块（图5A）。因此，含有GFP-LC3斑块的细胞有百分之多少的可能性是细胞自噬，这个标准并不合适（理论要求100%），除非建立一个

18、清楚的可以有效区分自噬激活和自噬非激活状态的阈值；这样，只有斑块数量大于一定数量的细胞才可以被认为是自噬。总之，在对所有细胞进行评估时，该方法优于对每个细胞中GFP-LC3斑块平均数量的定量。细胞内GFP-LC3斑块总面积可以用图像软件分析，但在这种情况下，排除由于大的GFP-LC3斑块聚集而导致的实验误差是很重要的（见下）。第二个不足是，当过表达LC-3或共表达易集聚性蛋白，GFP-LC3或甚者内源性LC3很容易集聚(Kuma et al., 2007)。荧光显微镜很难区分聚集的GFP-LC3和真正的自噬体。然而，一些特定的预防方法可以减少GFP-LC的集聚。推荐应用稳定的GFP-LC3转化

19、细胞株，我们可以挑选能够适度表达GFP-LC3的克隆以避免集聚造成的假象。当GFP-LC3重组体被用来进行瞬时转染实验时，就需要采取一些方法避免过度表达GFP-LC3导致的集聚假象。此外，通过设立阴性对照组可以区分GFP-LC3非特性的集聚和GFP-LC3特异性的向自噬体集聚，阴性对照组是GFP-LC3的C末端甘氨酸突变体GFP-LC3G120A，这个突变体缺乏泛素样偶联磷脂酰乙醇胺（PE）的功能(Tanida et al., 2008)。通过设立对照组，当自噬体数量确实增加时（相对于GFP-LC3非特性的集聚），我们可以识别野生型GFP-LC3斑块的增加而不是突变体GFP-LC3G120A斑

20、块增加（假设野生型和突变型GFP-LC3在同等表达水平）。通过建立GFP-LC3转基因小鼠，GFP-LC3标记方法已成功应用于在体哺乳动物自噬研究(Mizushima et al., 2004)。相似的方法也已应用在其他生物体模型中，包括果蝇(Rusten et al., 2004; Scott et al., 2004)、线虫(Meléndez et al., 2003)、植物(Yoshimoto et al., 2004)、斑马鱼(He et al., 2009)。在GFP-LC3转基因小鼠，GFP-LC3的表达毫无列外的受CAG启动子控制，在为期24小时进食后GFP斑块的增多可

21、以在几乎所有组织中观察到（图5B）。大脑似乎是个例外，即使48小时饥饿也很难观察到GFP-LC3斑块的堆积。这可能反映大脑中缺乏营养调控性细胞自噬，或者自噬体的快速形成。除了GFP-LC3转基因鼠外，组织特异性GFP-LC3和mCherry-LC3转基因鼠也被建立(Iwai-Kanai et al., 2008; Zhu et al., 2007)。这些系统性或组织特异性模型已被成功应用于显示自噬基因缺失小鼠的自噬诱导实验中的自噬体数量。也被应用于疾病和应激状态下的自噬研究，比如肝细胞表达a1-抗胰蛋白酶Z突变体(Kamimoto et al., 2006)，突变体细胞毒性对浦肯野细胞轴突的退

22、变研究(Wang et al., 2006)，心肌遭受过量表达的突变ab晶体蛋白(Tannous et al., 2008; Zhu et al., 2007)。因此，检测GFP-LC3转基因鼠的GFP-LC斑块是一种很好的方法，用来评估在体不同生理和病理生理刺激对自噬体数量的调节。生物化学方法LC3除了应用于荧光显微镜的检测方法外，也可以应用于生物化学方法检测自噬体数量。内源性LC3-I向LC3-II的转变以及GFP-LC3-I向GFP-LC3-II的转变可以借助LC3和GFP抗体用免疫印迹的方法检测。尽管LC3-II分子量比LC3-I大，但由于LC3-II的疏水性其在SDS-PAGE凝胶状

23、的泳动速度比LC3-I快，这种情况经常被误认为是由于LC3-II在处理过程碎裂（图4C和图6A）。LC3-II的量与自噬体的数量具有很好的相关性，更精确的说是自噬体膜上标记的LC3-II(Kabeya et al., 2000)。然而，并非所有的LC3-II都存在于自噬体膜上，一些LC3-II会异常的在非自噬过程中产生。比如，大量的LC3-II存在于FIP-200和Atg14缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞(Hara et al., 2008; Matsunaga et al., 2009)，Beclin1缺陷的胚胎干细胞(Matsui et al., 2007)和RNAi干扰抑制Beclin1、At

24、g13 、Atg14和Vps34表达的细胞中(Hosokawa et al., 2009; Itakura et al., 2008; Matsui et al., 2007; Zeng et al., 2006)，尽管自噬体形成和自噬流被完全或几乎完全抑制（见下）。在酵母中，当Atg1、2、6、9、13、14、16和17突变时，Atg8会发生酯化(Suzuki et al., 2001)。因此，在当自噬过程中的特定物质被基因阻断或药物干预的情况下，即使检测到LC3-II，细胞自噬也有可能被抑制。在这种情况下，就要用到诸如GFP-LC3标记法和自噬流检测来评估自噬活动。注意在这个领域，大多数研

25、究者在应用这些特定手段研究自噬时并没有考虑合适的测定自噬体数量或自噬活动。比如，溶酶体数量和活动并不是细胞自噬可信的通用指标，尽管在果蝇研究中是这样的。因此，在研究哺乳动物细胞自噬时，不推荐使用Lyso Tracker，吖啶橙和MDC，MDC起初被推荐作为特异性自噬体标记物，后来发现其与溶酶体具有很高的亲和力(Bampton et al., 2005; Mizushima, 2004)。其二，尽管哺乳动物LC3、Atg8和其他特定自噬基因在可以诱导自噬的应激条件刺激下可以转录上调(He and Klionsky, 2009)，但是并没有明确的证据说明细胞自噬活动增加。此外，相对于Atg蛋白表达

26、水平的调节而言，它们的持续表达、翻译后修饰以及与自噬过程中其他组分的相互作用在自噬过程中更为重要。因此，Atg的mRNA和蛋白表达水平并不适合作为检测细胞自噬的指标。自噬流检测以上章节讲述的试验方法用来检测细胞自噬体的数量，自噬体数量并不能总是反映细胞自噬活动的水平。正如以上的讨论（图3），自噬体的蓄积并不能反映细胞自噬的诱发，可能是自噬体产生增多或者是在自噬体成熟和自噬过程被阻断。这和LC3-II的测量相似。比如，用可以破坏溶酶体酸化的药物氯喹培养细胞时，即使非饥饿状态下LC3-II也会积累，因为基础状态细胞自噬中LC3-II的周转量被阻断（图6）。因此，简单的自噬体数量测定（电子显微镜和光

27、学显微镜测定LC3或GFP-LC3斑块）和LC3-II水平测定（免疫印迹）不能区分真正的细胞自噬诱导（比如饥饿）和自噬体成熟过程中被阻断或破坏。在多数实验中，区分自噬体蓄积是自噬诱导结果还是自噬下游步骤被阻断是必要的，细胞自噬流的测定可以区分这两种情况（图4D-4H）。通过电子显微镜定量分析自噬体和自噬溶酶体数量可以区分自噬激活（自噬体和自噬溶酶体数量都增加）和自噬体成熟受抑制（自噬体数量增加而自噬溶酶体数量不变）（图4A）。然而电镜不能直接观察溶酶体降解自噬底物的过程，所以电镜不能作为检测自噬流的方法。LC3周转量测定法当前测定细胞自噬流的主要方法之一是测定LC3周转量，这种方法基于LC3-

28、II在自噬溶酶体中降解的观察。如前文描述的一样，如果用抑制溶酶体酸化或抑制自噬体和溶酶体融合的药物氯化铵、氯喹或巴佛洛霉素A1处理细胞，或者是溶酶体蛋白酶抑制剂E64d和抑肽素A，LC3-II的降解就会被阻断，导致LC3-II的累积(Tanida et al., 2005)。于是，溶酶体抑制剂处理和不处理的样本之间LC3-II量的差别就代表了运输到溶酶体被降解的LC3量（图4D）(Klionsky et al., 2008a; Mizushima and Yoshimori, 2007; Rubinsztein et al., 2009)。比如，在非饥饿状态下氯喹处理后LC3-II水平增加（图

29、6B，比较1和2泳道）。然而在饥饿状态下，氯喹处理和非处理时LC3-II的差别更大（图6B，比较3和4泳道），提示饥饿时自噬流增加。尽管理论上测定LC3周转量很简单，但在一些实验中可以获得有意义的结果和可靠地测定自噬流。这或许反映了测定方法的高敏感性的本质，尤其是在基础状态下高的自噬流也可以测定（比如HeLa细胞在正常培养基中生长），但这种情况下由于自噬增加而引起的LC3周转量的改变却很难测定。在一些情况下，LC3周转量可以作为自噬流可靠的指标，然而在其他一些情况下，细胞自噬流测定就需要联合其他技术手段进行测定（见下）这种联合会得出更多的有用信息。LC3降解和自噬底物测定当LC3自噬降解时，总

30、LC3的消失反倒成为测定自噬流很好的指标（图4E）。当自噬诱导后LC3-II会短暂增加，然后更长时间自噬激活后LC3-II就会降低（比如2小时或更长的饥饿）(Mizushima and Yoshimori, 2007)。同样，饥饿状态的细胞会有大量的GFP-LC3斑块，但GFP-LC3胞浆和胞核信号在自噬诱导后双双减弱（图5A）。流式细胞仪可以定量的和敏感的测定总GFP-LC3的减少(Shvets et al., 2008)。因此，通过免疫印迹、流式细胞仪或荧光显微镜测定细胞总LC3量可以反映与细胞自噬流的关系。总LC3量的减少可以解释免疫组化研究LC3。LC3染色增加作为自噬激活的证据，然而

31、也可认为是自噬受抑制的证据，由于自噬降解LC3减弱引起。除了LC3外，其他自噬底物也可以用来测定自噬流。传统认为自噬是一个随机降解系统，但近期研究提示某些物质可以被自噬特异性降解，研究最为广泛的是p62。p62通过直接与LC3结合被特异的并入自噬体，通过自噬有效地降解（图4E）(Bjørkøy et al., 2005)；因此，细胞内总p62表达量可以逆过来反映自噬活动，即细胞内总p62表达量减少提示自噬增加。比如，饥饿诱导p62水平降低不能在自噬缺陷细胞中观察到，相反p62水平增加(Mizushima and Yoshimori, 2007)。在很多研究中，细胞p62这个

32、指标能与其他自噬流指标具有很好的关联性，总之这个指标似乎相当不错。然而，p62是否只通过自噬降解或者部分同通过泛素蛋白酶途径降解还是不清楚的。此外，和LC3一样，p62可以通过转录进行调节(He and Klionsky, 2009; Nakaso et al., 2004)，这样以来用p62和LC3作为自噬流指标就很混淆。考虑到这些潜在的限制，当用自噬底物水平测定评估细胞自噬流时，建议联合应用其他实验方法。mRFP-GFP-LC3溶酶体运输测定GFP标记的自噬底物比如GFP-LC3在溶酶体中荧光淬灭，基于这个原理的自噬流测定也使很有用的方法（图4F）。GFP是稳定折叠蛋白，对溶酶体蛋白酶相对

33、抵抗。然而，溶酶体内低的pH可以是GFP应该淬灭，这样使得跟踪GFP-LC3向溶酶体转运变得困难；事实上，多数GFP-LC3斑块并不定位在溶酶体(Bampton et al., 2005; Kabeya et al., 2000)。相反，红色荧光蛋白比如mCherry在酸性细胞器中荧光比较稳定(Katayama et al., 2008)，mRFP-LC3能够在自噬溶酶体中稳定的检测到（表2）。根据这两种荧光蛋白在溶酶体中的荧光淬灭不同，可以利用mRFP-LC3融合蛋白从形态学上跟踪自噬流（图4F和图5C）(Kimura et al., 2007)。利用这些新奇的荧光蛋白，自噬体和自噬溶酶体可

34、以分别被黄色（红色和绿色荧光综合）和红色（仅仅有红色荧光）信号标识。如果自噬流增加，黄色和红色斑块都会增加；如果，自噬体向自噬溶酶体转变过程被阻断，那么仅仅有黄色斑块的增加而不会伴随有红色斑块增加。尽管这种方法可以用作自噬流检测指标，但不能像其他检测方法那样提供溶酶体降解过程的详细信息。这种检测方法依据自噬体的酸化和降解能力。因此，有时也会观察到自噬溶酶体呈现黄色，这取决于溶酶体酶活性以及酸性溶酶体pH淬灭GFP荧光信号的速度。GFP-LC3裂解方法尽管GFP荧光在溶酶体酸性环境中能淬灭，但GFP仍然可以通过免疫印迹检测到，并且GFP比GFP-LC3融合蛋白更稳定（融合蛋白在溶酶体中被部分降解

35、，出现GFP片段）(Gao et al., 2008; Hosokawa et al., 2006)。因此，另一个检测自噬流的方法就是利用GFP抗体通过免疫印迹检测由溶酶体降解GFP-LC3融合蛋白而产生的GFP片段（图4G）。表达GFP-Atg8的酵母细胞中已经广泛应用这种方法检测自噬流，但却在哺乳动物细胞中很受限制。在一些情况下，由于溶酶体活性和酸度的不同（在不同细胞类型中有差别），用自噬体溶酶体降解GFP检测手段评估自噬流并不适合。长寿命蛋白降解1970年发展起来的评估细胞自噬流的传统方法之一是检测长寿命蛋白的降解（图4H）。在这个方法中，细胞在同位素标记的氨基酸（14C- or 3H-

36、valine or leucine）培养液中培养较长时间，用来标记长寿命蛋白，然后正常培养短暂时间用于洗脱同位素标记的短寿命蛋白，这些短寿命蛋白主要被蛋白酶降解。用自噬诱导刺激处理细胞后，测定细胞释放的降解蛋白量（通过测定上清液的放射性）。这可能是最定量的方法，因为这种方法可以提供精确的数量来反映所有细胞内长寿命蛋白命运以及避免由于测定单一自噬底物引起的缺陷。为了正确测定自噬降解长寿命蛋白（由于其他途径对长寿命蛋白的降解），必须比较自噬抑制剂处理和非处理组的长寿命蛋白自噬降解率。这种方法的缺点是实验结果的诠释依赖于所用自噬抑制剂的特异性和抑制效率（原因见下）。注意回顾本节，目前有几种不同的方法

37、用于检测细胞自噬流，包括LC3周转量测定、自噬底物总水平测定（LC3、GFP-LC3或p62）、mRFP-GFP-LC3颜色改变的分析、由GFP-LC3裂解产生的GFP测定和依赖于溶酶体降解的长寿命蛋白测定。在不同的细胞类型和不同的实验条件下，每种方法的有效性和局限性有所差别；因此，我们建议合理的选择不同方法用于测定自噬流。由于不同方法的局限性往往不重叠，所以推荐联合使用这些方法测定自噬流。这样，我们就可以在多数哺乳动物组织培养条件下可靠的测定自噬流或自噬活性。然而，尽有极少的方法用于测定在体的自噬流(Iwai-Kanai et al., 2008)。尽管有报道提示在自噬缺陷小鼠的组织中p62

38、水平增高(Komatsu et al., 2007)，但不清楚p62水平增高是否与在体自噬诱导有关。GFP-LC3转基因鼠用来测定在体自噬体数量，那么也可以建立GFP-RFP-LC3转基因鼠来测定在体自噬流。如何在病人体内或病人来源的血液和组织样本中建立测定自噬流的方法更为困难且极其重要。抑制自噬活动为全面了解特定生物过程，设定实验来调控该过程活动经常是很关键的。当前研究自噬中最严重问题之一就是缺乏高度特异的自噬抑制剂和激动剂。尽管如此，目前还是有几种调节剂可以利用，并且基因操作技术也能提供强有力的工具（图1）(Rubinsztein et al., 2007)。本章节以及下章节，我们分别讨论

39、不同的药物方法和基因方法对自噬的抑制和激活。因为自噬体形成需要III型PI3K蛋白激酶活性，所以体外最常用的药物法抑制自噬活动就用到PI3K抑制剂，比如渥曼青霉素、LY294002或3-MA(Blommaart et al., 1997; Itakura et al., 2008; Matsunaga et al., 2009)。然而所有这些抑制剂可以同时抑制I型PI3K蛋白激酶（抑制细胞自噬）和III型PI3K蛋白激酶（细胞自噬所需）(Knight et al., 2006)，其中一些III型PI3K蛋白激酶抑制剂比如LY294002和渥曼青霉素可以抑制mTOR（自噬抑制蛋白分子, 哺乳动物

40、雷帕霉素靶蛋白），通过其ATP结合位点起作用(Brunn et al., 1996)。此外，I型和III型PI3K蛋白激酶都可以调节多种细胞信号和膜转运过程，这些PI3K蛋白激酶抑制剂不是自噬所特有的。3-MA在非常高的浓度时（通常10 mM）可以抑制自噬，但它也作用于其他蛋白激酶并影响其他细胞过程如糖原代谢、溶酶体酸化(Caro et al., 1988)、胞吞作用(Punnonen et al., 1994)和线粒体通透性改变(Xue et al., 2002)。事实上，3-MA可以抑制蛋白酶水解过程甚者在Atg5缺失细胞，提示3-MA对蛋白降解作用已超出其抑制细胞自噬的范畴(Mizush

41、ima et al., 2001)。尽管PI3K抑制剂可以阻断自噬体形成，但其他实验中用到的主要药物抑制剂可以阻断自噬后期阶段（图1）。微管破坏剂（长春碱和有丝分裂抑制剂）可以抑制自噬体和溶酶体的融合，这个融合过程需要微管参与(Jahreiss et al., 2008; Kimura et al., 2008)。自噬溶酶体对自噬底物最后降解过程可以被氯化铵、巴佛洛霉素A1和溶酶体蛋白酶抑制剂比如E64d和抑肽素A等抑制（图1）。巴佛洛霉素A1最初报道可以抑制自噬体和溶酶体融合(Yamamoto et al., 1998)，最近的一项研究提示它主要的功能是通过抑制溶酶体酸化从而影响其自身的降解

42、，至少在特定条件下(Klionsky et al., 2008b)。微管破坏和溶酶体降解抑制除了影响自噬外，也可影响其他细胞功能如有丝分裂和胞吞作用，这就是一个主要的缺陷。因此，当应用PI3K抑制剂处理细胞时，对观察到的细胞表型变化必须给予解释。由于缺乏特异性细胞自噬抑制剂，我们建议研究者在应用药物抑制细胞自噬时不要对自噬功能下确定的结论。此外，药物学方面的研究应该和基因干预的方法联合起来，更特异的抑制细胞自噬。特异性抑制细胞自噬通路可以通过基因敲除或基因降低不同ATG基因的方式完成。到目前，自噬缺失或减弱已经在多种细胞建立，这些细胞缺乏Atg3(Sou et al., 2008)、Atg5(

43、Mizushima et al., 2001)、Beclin1(Qu et al., 2003; Yue et al., 2003)、Atg7(Komatsu et al., 2005)、Atg9a(Saitoh et al., 2009)、Atg16L1(Cadwell et al., 2008; Saitoh et al., 2008)、FIP200(Hara et al., 2008)和Ambra1(Fimia et al., 2007)。Atg4C (Mariño et al., 2007) 、LC3B (Cann et al., 2007) 和ULK1 (Kundu et

44、al., 2008) 基因缺失对在体表型的改变影响轻微，可能因为相关同分异构体对该基因的补偿。因此，这些基因不能作为RNAi干扰细胞自噬实验的首选沉默基因，尽管在特定细胞类型中，siRNA-ULK1对抑制自噬是有效的(Chan et al., 2007)。RNAi介导抑制细胞自噬的另一个问题是，自噬活动中某些特定Atg蛋白在很低水平时其功能也正常，比如Atg5 (Hosokawa et al., 2006)；这种情况下，RNAi介导沉默就需要完全抑制蛋白表达来观察细胞自噬受抑制。因此，在利用基因沉默方法研究细胞自噬时，我们推荐研究者不仅要确定每一个siRNA对自噬蛋白表达能有效抑制，同时要确定

45、自噬通路被有效抑制，可以通过已知的自噬诱导剂如饥饿来验证。基因抑制自噬的另一个成功方法是利用自噬蛋白的显性失活突变体。这些突变体包括ULK1激酶活性失活突变体（ULK1 K46N, ULK1 K46R, and ULK1 K46I）(Chan et al., 2009; Hara et al., 2008)、Atg4B C74A (Fujita et al., 2008a)和Atg16L1的缠绕区(Fujita et al., 2008b)。此外，野生型Atg12和Atg16L1(Fujita et al., 2008b)过表达以及偶联功能缺失的Atg5突变体（Atg5 K130R）(Pyo

46、et al., 2005)都可以引起显性失活效应。因为这些显性失活突变体的效应有时是根据环境而改变的或者说是细胞特异性的，因此每次实验确定其抑制效应是很重要的。必须注意到多数ATG基因缺失或显性失活自噬突变蛋白能够阻断自噬体形成的启动（图1，表1）。然而在Atg3敲除细胞(Sou et al., 2008)、Atg5敲除细胞(Mizushima et al., 2001; Nishiyama et al., 2007)和Atg4BC74A过表达细胞(Fujita et al., 2008a)中可以观察到异常延伸的膜结构，这就提示这些因子对完成自噬体闭合具有重要作用（图1），这些因子属于Atg1

47、2和Atg8/LC3偶联系统。理论上，自噬基因敲除抑制细胞自噬比药物试剂更加特异。然而，必须注意到Atg蛋白并不完全是自噬专有的；它们还具有自噬非依赖性功能，包括在细胞死亡、胞吞过程以及免疫相关GTP酶转运中的作用(Kroemer and Levine, 2008; Virgin and Levine, 2009)。此外，不同ATG基因敲除小鼠的表型没有重叠提示不同Atg蛋白具有不同功能。Atg3 (Sou et al., 2008) 、Atg5 (Kuma et al., 2004) 、Atg7 (Komatsu et al., 2005) 、Atg9a (Saitoh et al., 20

48、09)和Atg16L1(Saitoh et al., 2008)基因缺失小鼠的表型在本质上是一样的（即新生致死），而Beclin1(Qu et al., 2003; Yue et al., 2003)、FIP200(Gan et al., 2006)和Ambra1(Fimia et al., 2007)基因缺失小鼠会出现胚胎致死。因为每种独立的Atg蛋白都有可能具有自噬非依赖性功能，所以建议联合应用不同基因方法来抑制自噬基因，增加观察真正由于自噬活动抑制而引起表型改变的可靠性。自噬活动激活自噬激活的研究越来越受关注，不仅在于研究目的同时也在于其潜在的治疗目的。和自噬抑制剂一样，已有几种方法来研

49、究自噬激活，但是这些激活缺乏特异性。如前所述，饥饿是自噬活动最有效用的生理性诱导剂，在体内和体外都具有作用（体外实验中去除氨基酸比去除血清或生长因子更有效）（图1）。多数细胞系，自噬诱导在去除氨基酸一小时后就可以观察到；一个特殊的例外是某些肿瘤细胞系对饥饿诱导自噬有抗性。激活自噬的另一种方法是调节营养感应信号通路。最好的作用位点是mTOR，它是一个有效的自噬抑制剂。雷帕霉素（mTOR的抑制剂）以及类似物如CCl-779在体内和体外都可以激活自噬(Ravikumar et al., 2004)。在哺乳动物细胞，雷帕霉素在诱导细胞自噬和4E-BP1去磷酸化中似乎仅发挥了一部分效应(Thoreen

50、et al., 2009)，这是雷帕霉素的一个局限。近期研发了mTOR的ATP竞争性抑制剂比如Torin1(Thoreen et al., 2009)和PP242(Feldman et al., 2009)，这些药物对mTOR具有较高的抑制作用，可能是有前途的自噬诱导剂。值得注意的是饥饿和mTOR抑制都不是自噬特异性诱导剂；这些处理因素除了激活细胞自噬外，可以影响广泛的细胞应答、尤其是蛋白合成和细胞代谢。几种mTOR非依赖性自噬激活剂也有报道出现（图1）。锂通过抑制肌醇单磷酸酶（mTOR非依赖性）诱导自噬，但是锂也可以通过抑制GSK-3b（mTOR非依赖性）削弱自噬(Sarkar et al.

51、, 2008)；因此，如果锂被用于激活自噬，那么必须联合应用mTOR抑制剂。BH3类似物ABT737通过竞争性破坏Beclin1和Bcl-2或Bcl-XL之间的相互作用从而诱导自噬(Maiuri et al., 2007)。海藻糖和雷帕霉素小分子增强剂可以诱导自噬，其机制不清(Sarkar et al., 2007a; Sarkar et al., 2007b)。经过两次筛选由FDA认证的可以诱导mTOR非依赖性自噬的药物包括氟司必林、三氟拉嗪、哌咪清、尼卡地平、尼古地平、洛哌丁胺、胺碘达隆(Zhang et al., 2007)和维拉帕米、米诺地尔和可乐定(Williams et al.,

52、2008)。为了能够在体外或病人体内诱导最大的细胞自噬，需要联合应用mTOR非依赖性自噬的药物雷帕霉素或mTOR抑制剂的叠加效应以达到激活自噬的目的。结论我们讨论了当前用于测定和调控哺乳动物细胞自噬活动的技术和方法。没有一种完美的方法可以测定自噬体数量或自噬流，也没有一种完美的方法特异性的激活或抑制自噬通路。因此，必须强调没有单一金标准的方法测定或调控自噬活动。应该综合考虑同时应用不同的实验方法准确评估在任何给定的生物环境中自噬活动的状态和功能，这些方法没有重叠的限制条件。随着自噬分子机制的阐明，预料会有更好的方法用于测定细胞自噬和特异性药物用于调控自噬。这些研究进展会促进对自噬生物学功能的了

53、解以及成功开发临床药物调控自噬达到治疗疾病。参考文献1. Bampton ETW, Goemans CG, Niranjan D, Mizushima N, Tolkovsky AM. The dynamics of autophagy visualized in live cells: from autopha-gosome formation to fusion with endo/lysosomes. Autophagy. 2005;1:2336. PubMed 2. Bjørkøy G, Lamark T, Brech A, Outzen H, Perander M

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