免疫学技术和临床

1、CONFIDENTIALRev. 05/07/02美国贝克曼库尔特公司美国贝克曼库尔特公司免疫产品市场部免疫产品市场部洪军洪军 2007.4 安徽安徽CONFIDENTIALRev. 05/07/022内容摘要内容摘要CONFIDENTIALRev. 05/07/023什么是免疫分析的表现什么是免疫分析的表现CONFIDENTIALRev. 05/07/024免疫检测的分析表现免疫检测的分析表现准确性准确性精密度精密度灵敏度灵敏度特异性特异性检测线性范围检测线性范围试剂稳定性试剂稳定性定标周期定标周期开瓶效期开瓶效期CONFIDENTIALRev. 05/07/025免疫分析检测的临床表现免疫

2、分析检测的临床表现临床灵敏度和特异性是分析结果准确性的临床表现临床灵敏度和特异性是分析结果准确性的临床表现:理想状态理想状态健康人群健康人群疾病人群疾病人群灵敏度灵敏度 100%特异性特异性 60%特异性特异性 100%灵敏度灵敏度 50%灵敏度增加灵敏度增加 特异性增加特异性增加假阴性假阴性 假阳性假阳性Cut-off设置设置cutoff值在此处值在此处用于筛查分析用于筛查分析设置设置cutoff值在此处值在此处减少错误诊断带来的高花费减少错误诊断带来的高花费设置设置cutoff值在此处值在此处为了最少化错误结果为了最少化错误结果CONFIDENTIALRev. 05/07/026关于分析试

3、剂的检测灵敏度的定义关于分析试剂的检测灵敏度的定义分析灵敏度分析灵敏度( (Analytical Sensitivity)Analytical Sensitivity)v使用A点标准品v分析内的测试v最低可辨别0值的功能v分析试剂的理论上的极限功能灵敏度功能灵敏度( (Functional Sensitivity)Functional Sensitivity)v一系列不同浓度的标准品v分析间的测试,用0.05AccuTnI (ng/ml)Number of ObservationsFunctional Sensitivity = 0.032 ng/mlFunctional Sensitivit

4、y(Concentration is 0.032ng/ml w hen CV=20%)0204060801001200.0010.0100.1001.000AccuTn I Concentration (ng/ml)Total %CV0.032CONFIDENTIALRev. 05/07/028免疫分析的基本概念免疫分析的基本概念CONFIDENTIALRev. 05/07/029免疫分析的经典定义免疫分析的经典定义免疫分析（免疫分析（Immunoassay） 是一种技术用于检测和是一种技术用于检测和/或定量或定量 Y抗体（抗体（Antibody）通过一个特殊的只能和被分析物结合的抗体通过一个

5、特殊的只能和被分析物结合的抗体抗原（抗原（Antigen）CONFIDENTIALRev. 05/07/0210作为免疫反应，抗原抗体的选择是整作为免疫反应，抗原抗体的选择是整个免疫分析特异性和总体表现的关键个免疫分析特异性和总体表现的关键l如何选择好一个抗体去检测一个被检物质，而不如何选择好一个抗体去检测一个被检物质，而不与非常相似结构的其它物质有交叉反应，或漏掉与非常相似结构的其它物质有交叉反应，或漏掉须反应的物质，这是分析设计的重中之重须反应的物质，这是分析设计的重中之重l抗体的量必须恰当，过多会引起复合物的溶解抗体的量必须恰当，过多会引起复合物的溶解CONFIDENTIALRev. 0

6、5/07/0211关于抗体的亲合力关于抗体的亲合力抗体除了要求纯度外（单价特异性）还必须要求抗体除了要求纯度外（单价特异性）还必须要求亲合力，亲合力，效价指抗体的量，亲合力指抗体的质效价指抗体的量，亲合力指抗体的质在非竞争免疫反应的模式中抗体亲和力比标记物在非竞争免疫反应的模式中抗体亲和力比标记物的最低检测极限更能影响分析的灵敏度的最低检测极限更能影响分析的灵敏度在竞争法免疫反应的模式中抗体亲和力直接关系在竞争法免疫反应的模式中抗体亲和力直接关系到竞争的结果到竞争的结果对于样品中的干扰物质对于样品中的干扰物质, ,亲合力影响分析的抗干亲合力影响分析的抗干扰的能力扰的能力CONFIDENTIAL

7、Rev. 05/07/0212免疫分析的工作定义免疫分析的工作定义免疫分析免疫分析(Immunoassay) 是一种测试方式是一种测试方式,使用使用特殊的抗体与被检测物质的结合特殊的抗体与被检测物质的结合,此被检测物质不能此被检测物质不能通过简单的化学方法所容易检测到的通过简单的化学方法所容易检测到的.通常在检测系统中会使用到一种叫通常在检测系统中会使用到一种叫标记物（标记物（labeling）的的物质物质,常标记在抗体上常标记在抗体上通常会有一个通常会有一个分离（分离（separation）的过程在最后读取信的过程在最后读取信号前号前总是需要去仔细关注一下分析的总是需要去仔细关注一下分析的模

8、式（模式（format） CONFIDENTIALRev. 05/07/0213Access 的技术的技术免疫分析免疫分析 - “what”检测技术检测技术 化学发光化学发光 分离技术分离技术 磁性颗粒磁性颗粒 分析模式分析模式 灵活灵活 - “how”分析模式分析模式检测技术检测技术分离技术分离技术CONFIDENTIALRev. 05/07/0214检测技术检测技术免疫分析免疫分析检测技术检测技术(Detection) 有许多可用的方法有许多可用的方法 应用一些应用一些 “标记物标记物” 所产生的一些能量进行测定所产生的一些能量进行测定标记物可以或可以不被激活而产生能量标记物可以或可以不被

9、激活而产生能量通过一些相应的检测器对标记物产生的能量进行测通过一些相应的检测器对标记物产生的能量进行测定定分离技术分离技术 分析模式分析模式 CONFIDENTIALRev. 05/07/0215放射免疫分析放射免疫分析(Radioimmunoassay)优势优势优秀的灵敏度优秀的灵敏度较宽的检测线性范围较宽的检测线性范围局限性局限性标记物的半衰期短标记物的半衰期短试剂效期短试剂效期短检测结果的重现性差检测结果的重现性差每次检测都要做标准曲线每次检测都要做标准曲线分析的反应时间长，半天分析的反应时间长，半天2天天发射性污染有害发射性污染有害很难实现自动化检测很难实现自动化检测CONFIDENT

10、IALRev. 05/07/0216荧光荧光荧光素荧光素(Fluorophores) FIA，DELFIA原理原理荧光底物荧光底物, 4-MUP，或荧光标记物，或荧光标记物，镧系元素镧系元素EuEu3+3+,Tb,Tb3+3+,Sm,Sm3+3+吸收光为一个短波长的光，而发射光为一个长波长的光吸收光为一个短波长的光，而发射光为一个长波长的光通过荧光计检测通过荧光计检测优势优势与与RIA具有相似的灵敏度和检测线性范围具有相似的灵敏度和检测线性范围避免了避免了RIA对危害污染物处理的麻烦和半衰期短的问题对危害污染物处理的麻烦和半衰期短的问题局限性局限性可能会有来自样品中的一些自身荧光物质或短寿命的

11、荧光物质可能会有来自样品中的一些自身荧光物质或短寿命的荧光物质的干扰的干扰需用空白对照，速率法或延迟读数来克服需用空白对照，速率法或延迟读数来克服CONFIDENTIALRev. 05/07/0217酶酶-颜色的变化颜色的变化酶酶(Enzymes) - EIA原理原理在免疫分析结束后通过催化所加入的酶底物在免疫分析结束后通过催化所加入的酶底物典型的催化反应包括颜色的变化典型的催化反应包括颜色的变化,用分光光度计进行检测用分光光度计进行检测优势优势非常容易使用的技术用于一些定性的分析非常容易使用的技术用于一些定性的分析局限性局限性对定量分析所要求的灵敏度和宽线性难以实现对定量分析所要求的灵敏度和

12、宽线性难以实现ELISA技术必须每次定标技术必须每次定标试剂部分成分要复溶重组试剂部分成分要复溶重组反应时间较长反应时间较长CONFIDENTIALRev. 05/07/0218化学发光化学发光化学发光物质化学发光物质 - CLEIA原理原理不稳定的分子通过加入一些化学基团变得很稳定不稳定的分子通过加入一些化学基团变得很稳定,而移去这些起稳定作用的化学基团后而移去这些起稳定作用的化学基团后,分子结构变得不稳定分子结构变得不稳定发出光发出光（pH的改变，酶切作用，电激发等）的改变，酶切作用，电激发等）优势优势 具备具备RIA所拥有的优势所拥有的优势(灵敏度和宽线性灵敏度和宽线性),但但排除其缺点

13、排除其缺点用一个简单的光度计读数用一个简单的光度计读数非常低的背景干扰非常低的背景干扰类型类型 闪烁闪烁(flash), 持续持续(glow) 发光发光发光物质的稳定性发光物质的稳定性水溶液中的稳定性水溶液中的稳定性CONFIDENTIALRev. 05/07/0219化学发光物质化学发光物质AMPPD, Dioxetane (Lumi-Phos 530TM)-最稳定的化学发光物质（第三代）最稳定的化学发光物质（第三代）第一代：鲁米那第一代：鲁米那第二代：丫啶酯类，第二代：丫啶酯类，三联吡啶钌三联吡啶钌代表性分析系统代表性分析系统贝克曼库尔特贝克曼库尔特 - Access/Access 2 /

14、DxI800终点读数终点读数, 更稳定更稳定RLU00 5 10 时间时间(分钟分钟)55 60 CONFIDENTIALRev. 05/07/0220 ACCESS化学发光标记物的特点化学发光标记物的特点很宽的检测线性范围很宽的检测线性范围可检测到可检测到6个数量级个数量级(例如例如: 1 - 100,000 units)极高的灵敏度极高的灵敏度可检测到小到可检测到小到10-21 摩尔摩尔/升升很底的背景干扰很底的背景干扰对于一些超敏分析项目对于一些超敏分析项目,有相当接近零值的背景信号有相当接近零值的背景信号更超强的试剂稳定性更超强的试剂稳定性试剂效期试剂效期开瓶效期开瓶效期定标周期定标周

15、期CONFIDENTIALRev. 05/07/0221分离技术分离技术免疫分析免疫分析检测技术检测技术分离技术分离技术(Separation) 有很多方式有很多方式典型的是典型的是,特异性结合的分析物被保留而未结合物特异性结合的分析物被保留而未结合物质和无用的反应物被清除质和无用的反应物被清除 分析模式分析模式 CONFIDENTIALRev. 05/07/0222技术的创新技术的创新微粒子包被微粒子包被珠包被珠包被微孔包被微孔包被管包被管包被CONFIDENTIALRev. 05/07/0223磁颗粒包被技术磁颗粒包被技术磁颗粒抗体包被技术磁颗粒抗体包被技术磁颗粒均匀的悬浮于整个反应体系磁

16、颗粒均匀的悬浮于整个反应体系分析物在磁颗粒表面捕获分析物在磁颗粒表面捕获磁颗粒在磁场中被清洗磁颗粒在磁场中被清洗磁颗粒重新悬浮十分容易磁颗粒重新悬浮十分容易优势优势快速的反应动力学快速的反应动力学较少的样品量较少的样品量提高检测的灵敏度提高检测的灵敏度极好的批内重显性极好的批内重显性可以探针取放，实现自动化可以探针取放，实现自动化CONFIDENTIALRev. 05/07/0224分析模式分析模式免疫分析免疫分析检测技术检测技术分离技术分离技术 分析模式分析模式- 有很多种方式有很多种方式可定义为分析的可定义为分析的 “处方处方”设定一个最优化的模式设定一个最优化的模式(可变量可变量)去最优

17、化项目的去最优化项目的临床应用临床应用 CONFIDENTIALRev. 05/07/0225分析模式分析模式可变量可变量夹心法夹心法(Sandwich) vs.竞争法竞争法(competitive)标记物的放置标记物的放置同步同步(Simultaneous) vs. 分步分步(sequential)试剂试剂/样品加入的顺序样品加入的顺序孵育的次数孵育的次数(步骤步骤)清洗分离的次数清洗分离的次数(步骤步骤)试剂试剂/样品的体积样品的体积/浓度浓度孵育的时间孵育的时间孵育的温度孵育的温度CONFIDENTIALRev. 05/07/0226Access 的分析模式的分析模式基本分析模式基本分析

18、模式夹心法夹心法(Sandwich)竞争结合竞争结合(Competitive binding)试剂的加入，孵育和清洗试剂的加入，孵育和清洗 同步同步(Simultaneous) (1步步, 1次清洗次清洗)分步分步(Sequential) (2步步, 2次清洗次清洗)“Piggyback” (2步步, 1次清洗次清洗)CONFIDENTIALRev. 05/07/0227夹心法分析模式夹心法分析模式捕捉抗体捕捉抗体(Capture antibody)和标记抗体和标记抗体(labeled antibody)每个不同的抗体可以针对不同的抗原决定簇，每个不同的抗体可以针对不同的抗原决定簇，或二个在同

19、一个抗原决定簇或二个在同一个抗原决定簇分析更特异因为二个抗体同时反应分析更特异因为二个抗体同时反应适合于检测大分子物质适合于检测大分子物质b bhCG TSHIgEProlactinFSH LH Ferritin HBsAgCONFIDENTIALRev. 05/07/0228竞争法分析模式竞争法分析模式只有捕捉抗体只有捕捉抗体主要针对小分子物质检测主要针对小分子物质检测 没有足够表面积的分析物去符合没有足够表面积的分析物去符合 “夹心法夹心法” 要求要求T3 FT3 B12 Digoxin ProgesteroneT4 FT4 Folate Cortisol EstradiolCONFIDE

20、NTIALRev. 05/07/02CONFIDENTIALRev. 05/07/0230一个免疫分析项目的诞生一个免疫分析项目的诞生里程碑里程碑(Milestones)市场调研确定需求市场调研确定需求项目的详细特点要求项目的详细特点要求确定分析模式确定分析模式研发和优化研发和优化证明分析表现符合项目的详细特点要求证明分析表现符合项目的详细特点要求 (beta sites, clinical studies)提交注册提交注册CONFIDENTIALRev. 05/07/0231项目临床应用的要求项目临床应用的要求临床应用临床应用(claims)筛查（筛查（Screening）检测（检测（Det

21、ection）诊断（诊断（Diagnosis）分层（分层（Staging）预后（预后（Prognosis）监测（监测（Monitoring）CONFIDENTIALRev. 05/07/0232项目的临床应用与分析表现项目的临床应用与分析表现必须到达的分析表现特征必须到达的分析表现特征灵敏度（灵敏度（Sensitivity）特异性（特异性（Specificity）精密度（精密度（Precision）线性范围（线性范围（Dynamic range）其它其它CONFIDENTIALRev. 05/07/0233分析模式的选择分析模式的选择需考虑的因素需考虑的因素分析物的特征分析物的特征体积（竞争法

22、还是夹心法）体积（竞争法还是夹心法）浓度（一步法，二步法，反应时间等）浓度（一步法，二步法，反应时间等）潜在的潜在的“钩状效应钩状效应”（hook effect）- 假阴性假阴性解决的方法可以使用解决的方法可以使用2步法模式步法模式样品量和试剂量的平衡样品量和试剂量的平衡抗干扰能力抗干扰能力仪器的能力局限性仪器的能力局限性预处理的要求预处理的要求CONFIDENTIALRev. 05/07/0234试剂原材料的选择试剂原材料的选择原材料原材料抗体抗体标准品标准品封闭试剂（稀释液）封闭试剂（稀释液）清洗缓冲液清洗缓冲液YYYYYCONFIDENTIALRev. 05/07/0235抗体的选择抗体

23、的选择单克隆单克隆(Monoclonal) 和多克隆和多克隆( polyclonal)选择的标准选择的标准(criteria)特异性特异性(Specificity)灵敏度灵敏度(Sensitivity)供应能力供应能力(Supply)相关性相关性(Correlation)可制造性可制造性(Manufacturability)花费花费(Cost)CONFIDENTIALRev. 05/07/0236多克隆抗体多克隆抗体(Polyclonal Antibodies)免疫动物获得免疫动物获得,如羊或兔如羊或兔 时间长时间长,复杂的制作流程复杂的制作流程注射注射,监测滴度监测滴度(可能反复注射可能反复

24、注射)周期性的抽血获得周期性的抽血获得特征化特征化(Characterization)和纯化和纯化(purification)生产出生产出”鸡尾酒鸡尾酒”式的抗体式的抗体,针对所有抗原决定簇针对所有抗原决定簇适合对临床灵敏度要求较高分析测试适合对临床灵敏度要求较高分析测试YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYCONFIDENTIALRev. 05/07/0237单克隆抗体单克隆抗体(Monoclonal antibodies)YYYYYYYYYYYYY克隆的结果克隆的结果 抗体的产生具有高度抗体的产生具有高度的同源性和特异性并的同源性和特异性并针对一个抗原决定簇针对一个抗原决定簇 可以选择最

25、好的抗体可以选择最好的抗体 在大量生产时可以确在大量生产时可以确保持续的供应保持续的供应 适合对临床特异性和适合对临床特异性和批间一致性要求较高批间一致性要求较高的分析测试的分析测试CONFIDENTIALRev. 05/07/0238抗体的选择抗体的选择筛选筛选抗体需经过灵敏度，特异性和稳定性的评价抗体需经过灵敏度，特异性和稳定性的评价许多的抗原决定簇并非一种分子所独有许多的抗原决定簇并非一种分子所独有被测抗原的稳定性不同被测抗原的稳定性不同被测抗原的游离和结合模式被测抗原的游离和结合模式CONFIDENTIALRev. 05/07/0239案例案例: hLH 抗原位点图抗原位点图BetaA

26、lphaB-D 1hTSHhCGB-D 2hCGA-D 1hCGhFSHhTSHB-D 3A-D 3A-D 2hCGhFSHhTSHCONFIDENTIALRev. 05/07/0240肌钙蛋白肌钙蛋白 - I稳定性的问题稳定性的问题氧化的问题氧化的问题磷酸化的问题磷酸化的问题N-terminalC-terminal0102030405060708090100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200POO_ _Access 1st Gen31-3458-70 (cross-react)157-160PMP Detect Access AccuTnI _2

27、4-4041-49PMPDetectCONFIDENTIALRev. 05/07/0241等分子等分子(Equimolar) vs. 非等分子非等分子(non-equimolar)分析分析依赖于特异性抗体的选择依赖于特异性抗体的选择结合模式结合模式-一些位点被隐藏一些位点被隐藏游离模式游离模式-所有位点都暴露所有位点都暴露PSAACTPSACONFIDENTIALRev. 05/07/0242病人样品中可能自然产生一些针对动物免疫病人样品中可能自然产生一些针对动物免疫球蛋白的抗体球蛋白的抗体(通常是鼠或羊通常是鼠或羊)来源于暴露于这些动物或接受过动物血清的治疗来源于暴露于这些动物或接受过动物血

28、清的治疗分析的干扰分析的干扰可以在双单克隆夹心法分析模式中引起假阳性可以在双单克隆夹心法分析模式中引起假阳性可以在单克隆可以在单克隆/多克隆分析模式中出现假阴性多克隆分析模式中出现假阴性CONFIDENTIALRev. 05/07/0243假阳性假阳性 较多见较多见嗜异性抗体在捕捉抗体和检测抗体中搭桥嗜异性抗体在捕捉抗体和检测抗体中搭桥,出现在双单克隆夹心法模式中出现在双单克隆夹心法模式中CONFIDENTIALRev. 05/07/0244假阴性假阴性 较少见较少见嗜异性抗体争夺捕捉或检测抗体的抗原结合嗜异性抗体争夺捕捉或检测抗体的抗原结合位点位点,出现在单克隆出现在单克隆/多克隆分析模式中

29、多克隆分析模式中CONFIDENTIALRev. 05/07/0245封闭剂（稀释液）可以加在反应基质中或整合封闭剂（稀释液）可以加在反应基质中或整合在试剂盒内在试剂盒内动物蛋白（鼠，兔，羊等）动物蛋白（鼠，兔，羊等）各个厂家生产的分析试剂都有可能会不同程度各个厂家生产的分析试剂都有可能会不同程度的受到任何一个病人血清的影响！的受到任何一个病人血清的影响！CONFIDENTIALRev. 05/07/0246厂家产生的主定标曲线厂家产生的主定标曲线感觉节省感觉节省的校正型的校正型 2 点定标点定标会增加定标的频率会增加定标的频率对非线性的标准曲线可能会有问题对非线性的标准曲线可能会有问题(大大

30、多数的免疫分析产生的是非线性的标多数的免疫分析产生的是非线性的标准曲线准曲线)多点定标曲线多点定标曲线定量定量 典型的是典型的是6个水平个水平, 定性定性 典型的是典型的是2个水平个水平可以达到最大的灵敏度可以达到最大的灵敏度,准确性和精密度准确性和精密度可以有更长的定标周期间隔可以有更长的定标周期间隔CONFIDENTIALRev. 05/07/0247标准品标准品 参比物参比物参比物参比物纯化蛋白纯化蛋白(Purified protein)通常制作较便宜通常制作较便宜相对较短的稳定时间相对较短的稳定时间,需特殊的存放条件需特殊的存放条件一般需要冻干保存一般需要冻干保存可能会有批间的不一致性

31、可能会有批间的不一致性重组重组(Recombinant)相对昂贵相对昂贵很长的研发时间很长的研发时间更稳定和可靠更稳定和可靠可以以液体的模式供应可以以液体的模式供应CONFIDENTIALRev. 05/07/0248清洗液使用的类型和量，在清洗步骤结束后分析物提供的有效保留方式的能力和清洗残留的有效去除能力等，都会影响到分析表现清洗液中加入适当的表面活性剂可以去除不需要的生物活性物质 (干扰物质)CONFIDENTIALRev. 05/07/0249试剂的优化试剂的优化需优化参数需优化参数时间时间程序步骤程序步骤各类试剂浓度各类试剂浓度pH/离子强度离子强度需优化的内容需优化的内容扩散的速率

32、扩散的速率结合的速率结合的速率复合物的稳定性复合物的稳定性优化后达到的表现优化后达到的表现 灵敏度灵敏度(Sensitivity) 精密度精密度(Precision) 线性范围线性范围(Dynamic range) 准确性准确性(Accuracy) 相关性相关性(Correlation)CONFIDENTIALRev. 05/07/0250试验设计选择对临床检测结果的影响试验设计选择对临床检测结果的影响临床试验结果反映了试验过程中各种条件的优化临床试验结果反映了试验过程中各种条件的优化灵敏度特异性精确性试剂稳定性检测速度质量控制抗体 分析步骤 固相载体 检测技术 清洗 封闭试剂 贮存液 定标 标准化 仪器 客户需求客户需求CONFIDENTIALRev. 05/07/0251免疫分析设计及优化免疫分析设计及优化 开发免疫分析试剂盒的过程就是选择并优化各种实验条件，达到预期结果并能准确反应临床真实情况的过程达到预期结果并能准确反应临床真实情况的过程抗原抗原/抗体抗体分析模式分析模式分离技术分离技术检测技术检测技术总体分析表现总体分析表现CONFIDENTIALRev. 05/07/0252Beckman Access AccuTn-I符合符合NABC/IFCC/ESC/ACC的导则的导则要求要求最好的最好的99%分位值的比分位值的比值值没有嗜异性抗体没有嗜