实验三DNA的纯化与定量分析

1、授课教师 常祖明 学生人数 55 课 题 实验三 DNA的纯化和定量分析 授课类型 新授课 授课方法 讲授、演示 教学用具 多媒体、实验室设备 教学目的 学会DNA去RNA和杂蛋白纯化的方法；学会用分光光度计对DNA进行定量分析的方法 教学重点 理解实验过程中每一步操作的目的及原理 教学难点 用分光光度计定量分析核酸的原理 教学过程 一、实验目的1.对提取的DNA进行去RNA和杂蛋白的纯化；2.学会用紫外分光光度计法测定DNA浓度和纯度的原理和方法。二、实验原理（一）DNA纯化的原理提取的DNA中有RNA和蛋白质等杂质的存在，纯化的目的就是去除其中的RNA和蛋白质等杂质。RNA的去除可用核糖核

2、酸酶（Ribonuclease, RNase）。RNase是一类催化RNA降解为小片段的核酸酶。RNase A 对RNA有水解作用，但对DNA则不起作用，可以用来去除DNA制品中的污染RNA。经过上次课核酸的提取，已经将细胞内的核酸-蛋白质复合物分离开，大部分蛋白质被变性离心除去，但在提取的核酸中仍不可避免存在少部分的蛋白质没有被变性除去，所以本次实验加入蛋白质变性剂进一步去除蛋白质。（二）紫外吸收法测DNA的浓度和纯度原理核酸分子的基本结构是 磷酸-五碳糖-含氮碱基，其中含氮碱基有3种嘌呤和2种嘧啶，在这些嘌呤环和嘧啶环中含有共轭双键，共轭双键的特性是在260nm有特异的紫外吸收峰，其吸收的

3、强度和核酸的浓度成正比，可以利用这个特性测定核酸溶液的浓度。1.样品DNA浓度的计算方法规定双链DNA含量为50 g/ml、单链DNA含量为33 g/ml、 单链RNA含量为40g/ml时，在波长260nm处的吸光度为1，即 OD260=1。例如：某双链DNA样品测量结果OD260=1.5，则该样品的浓度为：1.5×50 g/ml=75 g/ml2. 样品DNA纯度的测定方法计算样品DNA在波长260nm与280nm吸光度的比值，即OD260/ OD280纯净的DNA：OD260/ OD280=1.8，纯净的RNA OD260/ OD280=2.0若1.8表明样品中有RNA污染若1.

4、8说明有蛋白质污染三、实验器材1.水浴锅2.离心机3.移液枪4.分光光度计四、实验材料及药剂实验材料：上次课提取的菠菜叶片核酸1.Tris饱和酚F 作用：强蛋白质变性剂。 F 商品信息：瓶/250ml。F 理化性质：为浅黄色透明液体，上层为Tris-HCl溶液，加有抗氧化的0.25% 8-羟基喹啉和0.1%的-巯基乙醇。F 储存：4避光保存。F 危害：Tris饱和酚有较强的腐蚀性，应尽量避免皮肤直接接触或吸入体内。如发现变为黄色或棕色，表明发生氧化，不能使用。2.氯仿（三氯甲烷）F 作用：蛋白质变性剂，加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚。F 商品信息：瓶/500ml。F 理

5、化性质：无色透明重质液体，极易挥发，有特殊气味。不溶于水，溶于醇、醚、苯。F 储存：保存在密封的棕色瓶中。F 危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空气逐渐被氧化生成剧毒的光气。3.异戊醇F 作用：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。F 商品信息：瓶/500ml。F 理化性质：无色液体，有不愉快的气味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有机溶剂。F 储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30。保持容器密封。应与氧化剂、酸类等分开存放，切忌混储。采

6、用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。储区应备有泄漏应急处理设备和合适的收容材料。F 危害：吸入、口服或经皮肤吸收有麻醉作用。其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有刺激作用，可引起神经系统功能紊乱，长时间接触有麻醉作用。易燃，其蒸气与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热能引起燃烧爆炸。4.无水乙醇F 作用：DNA沉淀剂、洗涤剂。F 商品信息：瓶/500ml，分析纯AR。F 理化性质：无色澄清液体。有灼烧味。易流动。极易从空气中吸收水分，能与水和氯仿、乙醚等多种有机溶剂以任意比例互溶。F 储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30。保持容器密封。应与氧化

7、剂、酸类、碱金属、胺类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。F 危害：易燃，具刺激性。蒸气与空气能形成爆炸性混合物，爆炸极限3.5%18.0%（体积）。5.核糖核酸酶A（RNase A）F 作用：去除DNA制品中的RNA。F 商品信息：小瓶/25mg。F 理化性质：类白色结晶或冻干粉。F 储存：-20保存。F 危害：6.三羟甲基氨基甲烷（Tris）F 作用：生物缓冲剂，用于缓冲液的制备，保护核酸。F 商品信息：白色塑料瓶/500g，试验试剂LR 。 F 理化性质：白色结晶或结晶性粉末。25时溶解度(mg/ml)：水550、无水乙醇14.6。水溶液在

8、空气中不吸收二氧化碳。对铜、铝有腐蚀作用。F 储存： 常温密封避光保存F 危害： 有刺激性五、实验试剂1.RNA酶（10mg/ml）：1mlRNase A 10mg + 2MTris-HCl（PH7.5）5l +5MNaCl溶液3l +992l水 1mlRNA酶 100沸水浴中20分钟（除去DNA酶） 冷却后-4保存（长期保存-20）Ø 【2MTris-HCl（PH7.5）缓冲液】配制：10mlTris 2.42g + 水5ml 用HCl调PH7.5 定容至10ml Ø 【5M NaCl溶液】配制：100mlNaCl 29.22g + 水90ml 加热到80溶解冷却后 定容

9、至100ml 高压灭菌备用2.氯仿-异戊醇（24:1）100ml-20ml=80ml氯仿 96ml + 异戊醇 4ml = 100ml，4保存3.酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）40ml氯仿-异戊醇（24:1）20ml + Tris饱和酚20ml = 40ml，4保存4.70%乙醇：10ml无水乙醇7ml +水3ml 70%乙醇10ml5.TE缓冲液 PH8.0 50ml10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液 0.5ml + 0.5M EDTA（PH8.0）0.1ml 定容到50ml 高压灭菌后冷却4保存Ø 【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml蒸馏水 80

10、ml + EDTA-2Na.2H2O 18.61g 用NaOH（约2g）调至PH8.0 定容至100ml 分装后高压灭菌备用。注：需加入NaOH调至PH8.0才能完全溶解。Ø 【10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液】的配制：10ml1M Tris-HCl PH8.0缓冲液100l + 水9.9ml 定容至10ml 10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液六、实验步骤（一）实验前准备：DNA样品（课前取出放至室温）1.实验仪器：水浴锅（37）、移液枪（2ml、5l、100µl、250µl、300µl、500µl）、离心机（1000

11、0、12000r/m） 2.实验试剂：TE缓冲液75ml（每管2ml+500l）、RNA酶150l（每管5l）、酚-氯仿-异戊醇3ml（每管100l）、氯仿-异戊醇3ml（每管100l）、无水乙醇7.5ml（每管250l）、70%乙醇9ml（每管300l）（二）DNA的纯化1.将DNA样品放至室温加入2ml TE缓冲液；Ø 目的：保护DNA。2.加入5l RNA酶，37水浴30分钟 ；Ø 目的：去除DNA制品中的RNA。3.加100µl酚-氯仿-异戊醇，颠倒混匀，10分钟，10000r/m离心10分钟，取上清液（含DNA）到一新的10ml离心管中；Ø 目

12、的：使蛋白质变性，溶液分相。经过离心溶液分成三层，上-中-下层：DNA溶液-变性蛋白-有机溶剂。4.加100µl氯仿-异戊醇, 颠倒混匀，10分钟，10000r/m离心10分钟，取上清液（含DNA）到一新的10ml离心管中；Ø 目的：进一步去掉变性蛋白，去掉多余的酚。5.加250µl的无水乙醇， 12000 r/m离心10分钟，弃乙醇。 Ø 目的：无水乙醇沉淀DNA。6.加300µl 70%乙醇洗涤DNA，10000 r/m，离心5分钟，弃乙醇。 Ø 目的：70%乙醇洗涤脱盐。提取DNA时会加入高浓度的NaCl盐溶液，Na离子会与DN

13、A结合形成DNA-阳离子盐溶于溶液中,再用无水乙醇可以将DNA-阳离子盐沉淀下来,但这样一来,DNA中就含有较多的盐离子,这势必会影响下一步实验的进行,所以要用70%乙醇洗涤DNA沉淀(因为在70%乙醇里DNA是不溶的,而盐离子却可溶),用无水乙醇则达不到这个目的!7.晾干，加500µl TE溶解DNA，-20保存。Ø 目的：一般长期保存DNA，贮存在TE缓冲液中比较好。TE为含EDTA的Tris-HCl(PH 8.0)缓冲液：其中比较关键的成分是EDTA，日常环境中不可避免的存在DNase，而DNase的活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，D

14、Nase I可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。TE中含有的EDTA可以螯合金属离子，从而使DNase失活。而Tris-HCl的作用主要是维持一定碱性PH值，有助于DNA的溶解和稳定。不加EDTA也是可以的，而且EDTA会影响下游酶切，连接反应以及质粒转染进细胞的效率，如果接下来要做这些实验是应该避免使用含EDTA的缓冲液的。短期储存DNA也可以使用ddH2O，有助于DNA连接等效果。（二）紫外吸收法测DNA的浓度和纯度1.开机。接通电源，打开开关，预热及自检20分钟左右2.稀释。用TE缓冲液把待测DNA样品稀释50倍3.调零。将做对照的TE缓冲液和待测DNA样品分别注入到不同的比色皿中，体积为3/4。将比色皿放入样品槽，关闭盖板。点击归零键，仪器自动校正零点4.测量。点击相关按钮，分别测量样品DNA在260nm和280nm处的光密度值（即OD值），待读数稳定后，每个样品测量3次，取平均值5.关机。打开盖板，取出比