丝状真菌瑞氏木霉生产重组蛋白的分子生物学研究进展

1、丝状真菌瑞氏木霉生产重组蛋白的分子生物学研究进展关键词：瑞氏木霉；遗传改造；基因定位置换整合；重组蛋白 摘要瑞氏木霉是自然界中普遍存在并有重要经济意义的一种丝状真菌，作为工业生产菌株生产多种水解酶类已有多年历史。本文报道了用基因工程手段对瑞氏木霉进行遗传改造，构造具新性状的重组菌株，用以过量产生同源和异源蛋白类物质的分子生物学研究进展。包括利用CBHI基因的强启动子在瑞氏木霉中过量表达瑞氏木霉内切葡聚糖酶、小牛凝乳蛋白酶、人抗体片段、哈茨木霉几丁质酶、Hormoconis葡萄糖淀粉酶等同源和异源蛋白以及利用在葡萄糖上强表达的启动子生产纤维素酶等遗传工程进行情况。 关键词瑞氏木霉；遗传改造；基因

2、定位置换整合；重组蛋白 1前言 多年以来，丝状真菌及其产生的酶类已广泛用于食品和食品加工业。由于其在工业上的巨大应用潜力，促进了大规模发酵工程、下游加工工程和对菌株的遗传改造的发展，其结果有助于将丝状真菌进一步应用于当今的工业生产。大多数情况下，自然发生的菌株产生我们所需蛋白的水平很低，以至不能在商业上加以利用。因此，为了得到所需的目的蛋白，需对自发菌株进行遗传改造。随着分子遗传技术和真菌基因转移系统的发展，利用基因工程方法对丝状真菌进行有目的的遗传改造，已以成为可能。 丝状真菌瑞氏木霉（Trichodermareesei）是多细胞的真核微生物，其作为工业菌株用于生产分解不同植物材料的酶类，包

3、括纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等，已有多年历史。瑞氏木霉所产生的一种主要的纤维酶一纤维二糖水解酶I（cellobiohydrolase1），由单拷贝基因编码，其产量可达瑞氏木霉胞外分泌性蛋白总量的50%1。由此可见，cbh1启动子是很强的启动子。因此在对瑞氏木霉的遗传改造中，常利用cbh1的启动子与终止子序列构建载体，并利用cbh1的前导肽序列引导重组蛋白进行分泌性表达。瑞氏木霉具有极好的合成蛋白和分泌蛋白的能力；并具有真核的分泌机制，很可能还具有与哺乳动物系统相似的蛋白修饰性能，如：高甘露糖型和N-糖基化2等。由于瑞氏木霉具有以上优良性能，再加之其工业化规模发酵条件已比较成熟，这些都

4、促进了对瑞氏木霉的遗传改造，为同源或异源分泌性蛋白的产生提供了一条行之有效的途径。 瑞氏木霉不仅具有适于蛋白生产的诸多优点，且对人没有毒性，在产酶条件下也不产生真菌毒素和抗生素。近年来的实践表明，经过基因工程手术改造的瑞氏木霉重组菌株是安全无害的3。 2过量生产同源蛋白一纤维素酶与木聚糖酶的生产 纤维素酶广泛用于淀粉加工、谷物酒精发酵、麦芽制备和酿造、动物饲养以及青贮饮料加工、果汁和蔬菜汁的提取等诸多方面，近年来被应用于纺织、造纸、制浆等工业。由于纤维素酶应用范围极其广泛，使得开发和改造纤维素酶生产菌株具有极强的现实意义。瑞氏木霉具有降解纤维素的完全酶系，所分泌的纤维素酶混合物通常包括内切葡聚

5、糖酶等多种酶活力。 1990年，Harkki等报道，通过基因定位置换整合使编码CBHI的基因失活，结果EGI的产量提高，不再产生CBHI4（见图1）。1993年，Karhunen等报道，将编码EGI的基因置于强启动子cbh1的控制之下，用此表达盒替换染色体的cbh1位点之后，EGI的产量是通常强纤维素分解菌所得CBHI量的2倍或者与其一样多5。其他人也曾报道过类似的情况。瑞氏木霉的一个或几个纤维素酶基因经基因位定位置换整合而失活6，7。这些菌株提供了一系列令人感兴趣的新酶混合物，即可用于工业生产，又可用于研究不同酶组分对各种纤维底物的分解作用。 但是，基因失活和基因置换的方法，可能不适用于需极

6、高特异和必须去除非必需酶活力的酶制剂。这是因为用于酶生产的培养基，可能会诱导产生大量其它水解酶类。而要使编码这些酶的基因都失活，在实际当中几乎是不可能的。为了防止这类问题的产生，Goldman(1992)、Schindler（1993）Nakari(1995)等人先后报道从瑞氏木霉中分离了非纤维素酶基因的启动子，包括pgk启动子、pkiA启动子、tefl启动子和一个在葡萄糖培养基上强表达但未知的cDNA1的启动子，这些启动子可以在葡萄糖培养基上启动合成所需要的纤维素酶，产生的酶制剂基本上没有其它纤维素酶活力。在cDNA1启动子控制下所合成的纤维二糖水解酶和内切葡聚酶产量最高可达50-100mg

7、/L，占分泌蛋白总量50%以上8。1996年，Kurzatkowski等构建了能在葡萄糖培养基上生长的瑞氏木霉的重组菌株，其携带的木霉糖酶或木霉糖酶结构基因是在内源丙酮酸激酶基因（pkil）表达信号的控制之下表达。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫染色，发现这两种类型的转化体在葡萄糖培养基上生长时，能分别分泌出木霉糖酶和木霉糖酶。对于木霉糖酶来说，最好的转化体产生的特异性酶活力为76U/mg；而对于木霉糖酶来说，则为145U/mg；都大大高出于自发菌株所产生的26U/mg9。 3异源蛋白的生产 3.1真菌酶蛋白类 将TrichodermaharzianumP1染色体上的内切几丁质酶基因分离，

8、导入丝状真菌瑞氏木霉，并在cbh1启动子过量表达。出发菌株瑞氏木霉RutC-30不具有任何内切几丁质酶活力。Tharzianum内切几丁质酶基因编码区前的区段的瑞氏木霉中能正确发挥功能。摇瓶培养产生130mg/L有活力的几丁质酶，比Tharzianum产生的内切几丁质酶活力提高大约20倍。瑞氏木霉RutC-30似乎能忍受内切几丁质酶具有抗植物病原真菌的活力10，已被用于植物病源真菌的生物防治。另据B.Cubero等（1997）报道，在瑞氏木霉组成型启动子ki和cbh2终止子的控制之下构建了两种载体，分别含有Tharzianum的基因chit33和bgn16.2的开放阅读框（chit33编码一种

9、内切几丁质酶，bgn16.2编码一种外切葡萄糖淀粉酶），并获得了稳定的拷贝转化体。对转化体bng16.2来说，整合到基因组中的基因拷贝数与mRNA和蛋白质的积累量和在葡萄糖阻遏或几丁质酶诱导条件下的胞外牧特性酶活力之间均呈正相关。该菌株比野生型菌株能更迅速地抑制病原真菌的生长。对转化体chit33来说，在葡萄糖阻遏的条件下。对转化体chit33来说，在葡萄糖阻遏的条件下，其产生的胞外几丁质酶活力是野生菌株的10倍11。 JoutsjokiVV(1994)报道，构建了两种一步基因置换载体。一种载体含有Hormoconisresinae葡萄糖淀粉酶P的基因组基因（gamP），另一种含有相应的cDNA，都在瑞氏木霉cbh1启动子控制下表达。这些载体经转化后置换瑞氏木霉的cbh1基因。在这两种载体中，cbh1启动子都能精确地连接到gamP蛋白质编码区上游，指导瑞氏木霉分泌出有活力的葡萄糖淀粉酶P（GAMP）。这表明gamP基因中内含子序列在瑞氏木霉中得到了正确的加工。研究结果表明，含有gamPcDNA的最优转化体能分泌大约700mg/L有活力的GAMP，是在H.resinae中产量的20倍12，但chb1基因被gamP基因组基因置换的瑞氏木霉