丙酮固定骨髓GMA塑料包埋切片的改良和应用

1、    丙酮固定骨髓GMA塑料包埋切片的改良和应用        目前常用的乙二醇-甲基丙烯酸酯（GMA)塑料包埋（塑包）剂室温下聚合时，不仅强烈放热，且可与蛋白质氨基终端结合而遮蔽细胞表面的抗原决定簇，使在塑包切片上无法进行免疫表型检测的研究。以冷丙酮固定结合简易三步塑包体系可对骨髓切片有效进行免疫酶标染色，报道如下。材料和方法1取材与处理血液病患者24例，男14例，女10例，年龄1679岁，骨髓增生异常综合征（MDS）难治性贫血（RA）1例，急性髓系白血病（AML）6例，

2、其中M11例，M23例，M31例，M61例，急性淋巴细胞白血病（ALL）3例，慢性髓细胞白血病（CML）慢性期3例，CML急粒变3例，慢性淋巴细胞白血病（CLL）2例，缺铁性贫血2例和溶血性贫血4例。各例均于治疗前局部麻醉后以B65-01型骨髓活检针于髂后上棘局部麻醉后作一步法抽吸?活检双标本取材。活组织块在23mm×1015mm。2改良GMA包埋剂配制甲液：甲基丙烯酸二羟基乙基酯单体（HEMA）40ml，过氧化甲酰0.09g，N-N二甲基苯甲胺2ml，充分摇匀，全溶后置棕色玻璃瓶内4保存备用。乙液：聚乙二醇（PEG400）10ml，N-N二甲基苯甲胺1ml，混匀，4备用。全包埋液配

3、制：甲液42份（本室特别模具84滴），加乙液1份（8号针头3滴）。3切片操作步骤骨髓块置于20丙酮（100ACS级）中，固定1.52.0小时，将已固定的活检块用针头挑入聚乙烯模具底部，用滴管吸取改良GMA单体甲液约2ml滴入模具中，置4冰箱中2小时，取出包埋模具用带8号针头的注射器吸取乙液约3滴加入模具中，迅速将甲、乙两液搅匀而成全包埋液，将活检块置于模具底部中央位置。静置于4冰箱内待其自聚过夜。包埋块修整后切割成34m厚切片，移入预先滴加数滴浓氢氧化氨液的水浴上，使之平坦悬浮于水面，冷水浴中裱片，常规贴片。4切片免疫组化染色用APAAP法，所用一抗包括：淋系CD2、CD3、CD5、CD7、C

4、D19、CD20、CD22，髓系CD13、CD15、CD33，红系GlyA，巨核系CD41，干/祖细胞单抗CD34，非系列特异性单抗HLA-DR以及白血病髓系前体细胞单抗C-myc。二抗为碱性磷酸酶结合的兔抗鼠IgG，三抗为APAAP酶标复合物。3者均于湿盒内室温下孵育30分钟，滴加碱性磷酸酶底物显色液20l后于37下孵育显色20分钟。水洗后Mayer苏木素复染胞核4分钟。水洗，甘油明胶封片后镜检。对照切片用正常AB血清替代一抗进行相应染色。结果造血组织内祖细胞、粒系、红系、巨核系和淋巴系细胞分化抗原定位与显色优良，RA1例，AML6例，CML慢性期3例和CML急粒变3例患者的切片以CD33、

5、CD15和CD13单抗染色时，各例原始细胞和髓系前体细胞的胞浆均呈阳性反应，但阳性标记物的表达呈显著异质性。本组RA1例，AML-M23例和CML急粒变2例的切片以单抗CD34作免疫标记检测时，M22例和急粒变1例患者的切片可检出少数CD34抗原表达的祖细胞。各例破骨细胞、血管周围外模型网状细胞和血管内皮细胞也呈CD34阳性反应。M61例、RA1例和溶血性贫血4例的切片以GlyA作标记显色时，各例切片内的幼红细胞集簇及渗出血管外的红细胞胞浆均呈玫瑰红色阳性反应，而同一切片内的淋巴细胞集簇则呈GlyA阴性，有助于鉴别。CML慢性期3例患者的切片以CD41单抗染色后，多形性巨核细胞（含直径15m的

6、微巨核）的胞浆均呈深红色阳性反应，提示此法对微巨核显色优良，利于精确识别，ALL3例和CLL2例以全-B（CD19、CD20、CD22）和全-T（CD2、CD3、CD5、CD7）单抗标记时，ALL1例和CLL2例的白血病性B细胞上分别显示不同程度的CD19、CD20和CD22抗原表达。本组CML急粒变2例、M21例和M61例患者的切片作了原癌基因C-myc表达的检测，各例均可显示弥散性或簇性分布的C-myc阳性标记细胞。M21例化疗前切片内白血病细胞的C-myc表达以“弥散性”分布模式为主，积分值高达116，化疗取得缓解后，切片内C-myc蛋白指数即降至54，表达也转为单个或小簇分布为主。讨论

7、目前塑料包埋免疫组化检测中常用的制冷?真空系统操作较为复杂，难以在一般骨髓病理实验室中推广应用。故探讨能有效进行免疫标记物表达检测的简易塑包方法具有现实意义。Beckstead1最先使用多聚甲醛固定骨髓块，并于低温下进行GMA包埋，切片需经胰蛋白酶消化处理，不仅累及细胞形态及其抗原性，而且T细胞亚群的标记抗原也无法被证实。Casey等2进而免去胰蛋白酶消化这一步，免疫标记前加5g/L甲基苯甲酸盐于GMA单体浸渍液中，以包埋丙酮固定的骨髓块。证明甲基苯甲酸盐能保证GMA聚合过程中抗原不被遮蔽。我们以冷丙酮固定，GMA单体浸渍以及聚合等三步简易操作方法，并将塑包块置20冰箱内贮存数月后再切片，主质

8、内各系血细胞的分化抗原定位与显色优良，免疫反应性能持久保存。本研究首次证明塑包切片也能显示C-myc阳性标记细胞的有无。单抗C-myc经APAAP免疫酶标染色后，在计数C-myc阳性标记细胞的同时，我们也能对切片内C-myc蛋白相对量经积分化算出C-myc蛋白指数，为深入开展不同切片内C-myc基因相对含量的比较研究提供了新的手段。作者单位：200233上海第二医科大学市六临床医学院、上海市第六人民医院血液科参考文献：1Beckstead JH. Optimal antigen localization in human tissues using aldehyde fixed plastic embedded sections. J Histochem Cytochem, 1985, 33:954-958.2Casey TT, Cousor J, Collins R. A simplified plastic embedding and immunohistologic techniq