BTLA在T细胞上的表达和功能

1、BTLA 在T细胞上的表达和功能 作者：王月颖,王雪峰, 张学光, 顾宗江【摘要】 目的: 研究BTLA（B and T lymphocyte attenuator）在T细胞上的表达和功能。方法: 分离纯化人外周血T细胞, 流式细胞术检测BTLA在不同T细胞亚群上的表达。进一步用CD3抗体分别和游离、 包被以及抗Fc段二抗交联的BTLA激发单克隆抗体（mAb）或HVEMFc融合蛋白共同刺激T细胞活化, MTT检测细胞增殖。结果: BTLA组成性表达于CD3+、 CD4+和CD8+T细胞表面。游离的BTLA mAb和HVEMFc融合蛋白均不能抑制CD3刺激的T细胞增殖, 然而包被和交联后的BTL

2、A mAb和HVEMFc融合蛋白则能够明显抑制T细胞增殖。结论: BTLA的活化能显著抑制CD3抗体所活化的T细胞的增殖。 【关键词】 BTLA; 共刺激分子; 抑制; T细胞T细胞的活化依赖于双信号的共同刺激。T细胞受体（TCR）识别抗原提呈细胞（APC）上抗原肽MHC复合体, 启动了T细胞活化的第一信号; APC上共刺激分子与T细胞膜上相应受体结合则提供了T细胞活化的第二信号。第二信号既包括增强T细胞反应的正性信号, 也包括抑制T细胞反应的负性信号。CD28是促进T细胞初始活化的重要共刺激分子, 能够增进IL2的合成, 维持T细胞反应; 与之相反, CTLA4抑制T细胞活化, 然而, 它们

3、都与表达在APC表面的B71和B72结合1。CD28家族另外一个刺激分子ICOS与B7h结合, 增强效应T细胞的反应2。PD1是继CTLA4之后发现的负性共刺激分子, 具有两个配体PDL1和 PDL23。BTLA（B and Tlymphocyte attenuator）是CD28家族新近发现的负性共刺激分子4。BTLA-/- T细胞对CD3mAb刺激的增殖较野生型T细胞更敏感5。与其他家族成员不同, BTLA的配体不属于B7家族成员, 而是肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的HVEM6。值得一提的是, HVEM与TNF家族配体LIGHT结合能增强T细胞活化7, 然而, HVEM与BTLA结合却

4、产生抑制T细胞的作用8, 因此HVEMBTLA是一对比较特殊的信号分子。1 材料和方法1.1 材料淋巴细胞分离液Ficoll(上海生化试剂二厂); 96孔细胞培养板（Costar公司）; RPMI1640培养基（Gibco公司）; 胎牛血清FCS（杭州四季青公司）; 激发型CD28 mAb和BTLA mAb 8H9均为本室自行研制; CD3激发型抗体（Beckman Coulter）; 人HVEMFc融合蛋白（R&D公司）; PE标记鼠抗人BTLA抗体（eBioscience）; FITC标记鼠抗人CD4和CD8抗体（eBioscience）; 羊抗鼠Fc段抗体和羊抗人Fc段抗

5、体（crosslink 抗体, Bethyl公司）; 人T细胞阴性分选试剂盒（StemCell Technologies）。二氧化碳培养箱（Jouan公司）; 流式细胞仪（BeckmanCoulter公司）。1.2 方法1.2.1 外周血T细胞分离及纯化采集健康志愿者外周全血, 经Ficoll密度梯度离心获得外周血单个核细胞（PBMC）, 进一步按人T细胞阴性分选试剂盒说明书方法, 磁珠分离T细胞, 检测 T细胞纯度 96%。1.2.2 流式细胞检测BTLA在T细胞的表达分离纯化的T细胞用PBS洗涤后重悬于100L PBS中, 加入PE标记鼠抗人BTLA抗体、FITC标记鼠抗人CD4、CD8抗

6、体, 4作用30 min, 洗涤后上流式细胞仪检测。1.2.3 T细胞的活化 用CD3抗体分别和不同浓度的8H9、人HVEMFc融合蛋白及对照IgG共同包被96孔板, 4过夜,用PBS洗涤; 或CD3抗体包被过夜后加入不同浓度的游离8H9、人HVEMFc融合蛋白及对照IgG。将分离纯化的T细胞密度调整为1×109/L, 每孔加入100L。在抗体交联实验中, 96孔板CD3抗体包被过夜后, 加入不同浓度的游离8H9、人HVEMFc融合蛋白及对照IgG, 继而加入T细胞, 置于37、50 mL/LCO2培养箱中孵育1 h, 然后加入抗Fc段抗体, 37、50 mL/L CO2培养箱中继续

7、培养。1.2.4 T细胞增殖检测刺激活化的T细胞培养3d, 于培养的最后4h加入20L MTT溶液（5g/L）继续培养, 吸取上清, 加入100L酸化异丙醇彻底溶解结晶, 用酶标仪A570波长比色。1.2.5 统计学分析数据用平均值x±s表示。两组样本均数的比较采用t检验, 以P<0.05 为有统计学意义。2 结果2.1 BTLA在静止T细胞上的表达流式细胞术检测显示, BTLA组成性表达于静止T细胞上。大约84% CD3+T细胞上表达BTLA, CD4+T上的表达高于CD8+T, 表达量分别是87%和77%（图1）。2.2 BTLA mAb 8H9对T细胞增殖的影响B

8、TLA的胞内区包含2个免疫受体酪氨酸抑制性基序(ITIM), 基序中的酪氨酸磷酸化后, 可以募集酪氨酸磷酸酶SHP1和SHP2, 发挥抑制作用4。我们用CD3抗体包板, 联合BTLA mAb 8H9共同刺激纯化T细胞。结果表明, 游离的8H9不能抑制T细胞的增殖。然而, 8H9与CD3抗体一起包板后, 和对照抗体相比, 明显产生抑制T细胞增殖的作用（P<0.05）, 并且抑制效果具有浓度依赖性（图2A）。以前的研究表明, mAb与微球相偶联, 可以在液相中发挥作用9。本实验在CD3和游离8H9刺激的T细胞中加入针对Fc的二抗, 对8H9 mAb进行交联, 结果表明8H9经过交联后

9、, 能明显抑制T细胞的增殖（P<0.05）, 并且与包板的8H9相似, 随着浓度的增加, 抑制作用更明显（图2B）。2.3 HVEMBTLA通路抑制T细胞增殖表达在T细胞上的HVEM与其配体LIGHT结合, 可以促进T细胞的活化, 而与BTLA结合, 则通过后者传递抑制信号。实验中利用HVEMFc融合蛋白来研究HVEMBTLA这对信号分子对T细胞的影响。与8H9相同, 包被固定的HVEMFc可产生抑制作用, 而游离的HVEMFc不能抑制CD3活化的T细胞增殖（图3A）。当用抗Fc抗体将HVEMFc融合蛋白交联后, 亦能明显抑制T细胞增殖（P<0.05, 图3B）,

10、并且HVEMFc融合蛋白在CD3抗体小于0.5 mg/L时抑制效果最好（P<0.05, 图3C）。3 讨论 BTLA是CD28家族发现的第3个抑制性共刺激分子。与CTLA4和PD1相似, BTLA分子的酪氨酸经诱导磷酸化后, 可以招募SHP1和SHP2, 产生抑制信号, 阻碍T细胞的活化4。我们的研究表明, BTLA组成性高表达于初始T细胞表面。与此不同, CTLA4和PD1仅诱导表达于活化T细胞表面1, 由此推测这些分子可能在T细胞免疫应答的不同阶段发挥作用。 共刺激分子在免疫应答的各个阶段都起着非常重要的作用。以往利用共刺激分子配体的Fc融合蛋白进行研究时, 需将Fc融合蛋白

11、包被固定在培养板上, 才能发挥作用。当Fc融合蛋白未固定, 而在液体中处于游离状态时, 就无法对共刺激分子发挥作用7。在利用针对共刺激分子的mAb进行研究时, 也会遇到相同的问题, 即大部分mAb需要包被固定在板上, 才起作用。如果mAb游离在液体中, 就起不到有效的作用。这为研究共刺激分子在免疫应答各个阶段的不同时相的作用, 带来许多困难和不便。还有研究发现将mAb与微球通过化学方法偶联在一起, mAb就可以在液相中发挥作用9。但mAb与微球的偶联则带来了操作上的繁琐与不便。在本实验中, 我们针对在液相中处于游离状态的mAb或Fc融合蛋白, 加入抗Fc段的抗体, 将mAb或Fc融合蛋白上的F

12、c段进行交联（crosslinking）, 起到了加强mAb或Fc融合蛋白的作用, 使其在液相游离状态下, 亦能起到有效的作用。此方法简便易行, 容易控制。由于BTLA与其他两个负性共刺激分子CTLA4和PD1的表达时相有所不同, 因此, 在采用上述交联方法后, 我们对BTLA在免疫应答不同时相的作用, 分别进行了研究, 取得了有意义的结果, 将另文发表。【参考文献】 1Coyle AJ, GutierrezRamos JC. The expanding B7 superfamily: increasing complexity in costimulatory signals regulat

13、ing T cell functionJ. Nat Immunol, 2001, 2(3): 203-209.2Tafuri A, Shahinian A, Bladt F, et al. ICOS is essential for effective Thelpercell responsesJ. Nature, 2001, 409(6816): 105-109.3Latchman Y, Wood CR,Chernova T, et al. PDL2 is a second ligand for PD1 and inhibits T cell activationJ. Nat Immunol

14、, 2001, 2(3): 261-268.4Watanabe N, Gavrieli M, Sedy JR, et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA4 and PD1J. Nat Immunol, 2003, 4(7): 670-679.5Krieg C, Boyman O, Fu YX, et al. B and T lymphocyte attenuator regulates CD8+ T cellintrinsic homeostasis and memory cell gen

15、erationJ. Nat Immunol, 2007, 8(2): 162-171.6Sedy JR, Gavrieli M, Potter KG, et al. B and T lymphocyte attenuator regulates T cell activation through interaction with herpesvirus entry mediatorJ. Nat Immunol, 2005, 6(1): 90-98.7Tamada K, Shimozaki K, Chapoval AI, et al. LIGHT, a TNFlike molecule, cos

16、timulates T cell proliferation and is required for dendritic cellmediated allogeneic T cell responseJ. J Immunol, 2000, 164(8): 4105-4110.8Tao R, Wang LQ, Murphy KM, et al. Regulatory T cell expression of herpesvirus entry mediator suppresses the function of B and T lymphocyte attenuatorpositive effect