HIF1α基因表达下调对人结肠癌SW480细胞增殖和VEGF表达的影响

1、HIF1基因表达下调对人结肠癌SW480细胞增殖和VEGF表达的影响 【摘要】目的:研究转录因子缺氧诱导因子1（HIF1）在缺氧条件下对人结肠癌SW480细胞增殖的作用，以及HIF1对血管内皮生长因子（VEGF)表达的影响，研究HIF1调节SW480细胞增殖的机制.方法:构建针对HIF1的pSuperEGFPsiRNA表达载体，转染SW480细胞，抑制HIF1的表达，RTPCR和WesternBlot检测抑制结果；MTT法检测HIF1被抑制后，SW480在缺氧培养条件下的增殖情况；RTPCR和WesternBlot检测VEGF的表达.结果:缺氧培养条件下，HIF1和VEGF表达明显上升；转染p

2、SuperEGFPsiRNA表达载体后，SW480细胞HIF1mRNA和蛋白质的表达大幅下降；SW480细胞增殖下降（P<0.05）；而在缺氧培养条件下有较高表达的VEGF，其mRNA和蛋白质的表达也大幅下降.结论:HIF1在缺氧条件下，对SW480细胞在增殖有影响，其机制可能是通过在缺氧时上调节VEGF等细胞生长因子的表达，进而调节肿瘤细胞生长. 【关键词】缺氧诱导因子血管内皮生长因子类RNA干扰SW480细胞增殖 0引言 缺氧诱导因子1(hypoxiainduciblefactor1,HIF1)是调节肿瘤细胞缺氧反应的主要转录因子.HIF1是决定HIF1活性的亚单位，其在许多

3、肿瘤中高表达，与肿瘤高度侵袭性、易转移、对放化疗不敏感和预后不良密切相关1；同时HIF1与肿瘤细胞增殖、细胞凋亡、糖代谢、血管生成有紧密联系2.以HIF1为靶点的抗肿瘤治疗正成为许多基础和临床研究的热点.RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是一种封闭基因表达的有效方法.为探讨以HIF1在SW480细胞增殖中的作用，及以HIF1靶点的RNA干扰对结肠癌的作用,我们构建了针对HIF1的短发夹RNA（shorthairpinRNA，shRNA）表达载体，抑制其表达，研究HIF1表达被抑制后，SW480细胞增殖及其VEGF表达的变化. 1材料和方法 1.1材料 脂质体Lipofect

4、amineTM2000购自Invitrogen公司；兔抗HIF1多克隆抗体、VEGF多克隆抗体购自SantaCruz公司，羊抗兔HRP二抗购于北京中杉金桥公司；逆转录试剂盒和T4DNA连接酶购自MBI公司；Tag聚合酶和TRIZOL试剂购自Gibco公司；蛋白酶抑制Cocktail购于Sigma公司；PVDF膜购自Millipore公司；ECL试剂盒购于Pierce公司；HIF1靶shRNA和无义对照的DNA寡核苷酸链和PCR引物由博士德公司合成；pSUPEREGFPsiRNA表达载体由第三军医大学陈春霖博士赠送.SW480细胞株由四川大学华西医院肿瘤生物治疗研究室赠送. 1.2方法 1.2.

5、1细胞常氧和缺氧培养 SW480细胞在含100mL/L小牛血清的RPMI1640中培养（37，210mL/LO2，740mL/LN2，50mL/LCO2）；低氧条件建立：将生长状态良好的SW480细胞置于三气培养箱中低氧培养(10mL/LO2，50mL/LCO2，940mL/LN2)，模拟肿瘤组织缺氧微环境. 1.2.2人HIF1siRNA表达载体的构建 根据文献3报道，合成构建人HIF1siRNA表达载体的一对互补19nt寡核苷酸链，两端带有BglII和HindIII酶切位点.siRNA和无义对照序列都在GenBankdatabase进行BLAST检索，所设计的siRNA序列仅仅与人HIF1

6、序列相配，而无义寡核苷酸对照链顺序不与任何人基因序列相配. 将正义和反义寡核苷酸链各1nmol在50L退火缓冲液中退火，退火程序按954min，7010min，缓慢冷却至室温，形成带酶切位点的寡核苷酸双链.取0.02nmol退火双链与200ngpSUPEREGFP载体，在含T4DNA连接酶的20L反应体系中，室温连接6h.重组体转化DH5感受态细菌，筛选Kan+抗性克隆，抽提质粒，Bgl和Hind双酶切后琼脂糖电泳检测，测序分析验证. 1.2.3细胞转染和筛选SW480细胞计数1×105接种于六孔板，培养至90%融合，在LipofectamineTM2000脂质体介导下进行HIF1s

7、hRNA表达载体和无义shRNA表达载体的转染，空白对照组孔内加入含相同浓度脂质体的RPMI1640培养液.6h后移去含脂质体的培养液，换为含100mL/L血清的RPMI1640培养液继续培养.48h恢复生长后，用含200g/LG418的培养液筛选6d，再用含G418400mg/L的培养液筛选3d，换含200g/LG418的培养液继续扩大培养，进行后续操作或冻存. 1.2.4半定量RTPCR检测TRIZOL法提取各组细胞的总RNA并定量；各样本取1g总RNA，按MBI公司试剂盒说明进行逆转录；取cDNA5L/样本，常规PCR反应，GAPDH为内对照.PCR引物如下：HIF1上游5CTGACCC

8、TGCACTCAATCAA3，下游5CTTTGCTTCTGTGTCTTCAGCAGCA3（245bp）；VEGF上游5ATGAACTTTCTGTCTTG3，下游5TGCATGGTGATGTTGGAC3（382bp）；GAPDH上游5ACCACAGTCCTGCATGCCATCAC3，下游5TCCACCACCCTGTTGCTGTA3（450bp）.20g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，GeneGENIUS凝胶成像系统扫描条带灰度值并进行分析，每组检测5个样本，RTPCR产物比值=(HIF1（VEGF）mRNA灰度值/内对照GAPDHmRNA灰度值)×100%. 1.2.5Western

9、Blot检测冷PBS液洗细胞一次，用含Cocktail蛋白酶抑制剂的冷RIPA细胞裂解液收获蛋白，Bradford法定量，70g/泳道进行SDSPAGE；以100V，90min将蛋白转移至PVDF膜；封闭液（含5g/L脱脂奶粉)封闭2h，加入一抗(1400,V/V)4过夜，二抗(11500，V/V)室温下杂交45min，洗膜后用ECL试剂盒进行发光反应，压片、显影、定影，观察蛋白印迹. 1.2.6MTT试验将细胞接种于96孔细胞培养板，每孔1×104个细胞，细胞贴壁后缺氧培养24h，分别加入MTT，于酶标免疫测定仪上测其A490值,具体方法见文献.分别设空白对照组、无义siRNA组、

10、有义siRNA组，每组均设6个平行孔，并重复3次(批)实验.细胞存活率=（实验组A值/对照组A值）×100%. 统计学处理：A值用x±s表示,采用SPSS11.5统计分析软件对数据进行分析，不同组间比较采用单因素方差分析,P<0.05表示有统计学意义. 2结果 2.1RNA干扰抑制SW480细胞HIF1的表达 缺氧24h后，SW480细胞HIF1mRNA表达与常氧条件下相同，均有较高表达.稳定转染HIF1siRNA表达载体后(图1,2),SW480细胞HIF1mRNA的表达明显被抑制(28.7±3.5)，而无义siRNA载体组没有明显变化(87.8&

11、#177;3.1）,二者差异显著(P<0.01，n=5).HIF1蛋白在常氧条件下表达微弱，缺氧培养24h后表达量显著上升.稳定转染后缺氧培养，HIF1siRNA正义组HIF1蛋白的表达明显下调，而无义siRNA载体组和空白HIF1蛋白表达没有变化（图3），结果显示HIF1蛋白质表达受低氧诱导，而HIF1siRNA表达载体转录的siRNA通过降解HIF1mRNA，有效抑制其蛋白合成. 2.2HIF1表达抑制后对VEGF的影响 如图2，4所示在常氧条件下培养的SW480细胞中，VEGFmRNA的表达较低.缺氧24h后，其表达有明显的升高；HIF1siRNA表达载体稳定转染细胞在缺氧

12、培养24h，VEGFmRNA的表达也明显随HIF1下降(41.0±3.4)；而无义siRNA载体组VEGFmRNA表达变化不明显（84.4±4.5），二者有明显的差别（P<0.01，n=5）. SW480细胞缺氧后，VEGF蛋白表达有明显的升高；但当HIF1的表达被抑制后，VEGF蛋白的表达也明显下降；而无义siRNA载体组VEGF蛋白表达没有变化（图5），显示HIF1的表达被抑制后，VEGF蛋白水平被有效的下调，说明缺氧条件下HIF1是VEGF表达的调控因子，HIF1被抑制能下调VEGF的表达. 23HIF1RNA干扰对SW480细胞增殖的影响 在缺氧24h

13、后，MTT检测结果显示，HIF1有义siRNA组细胞A值（0.67±0.07）明显低于HIF1无义siRNA组(1.05±0.04),空白对照组细胞A值最高（1.15±0.04）,HIF1有义siRNA组与两对照组比较有明显差异.以空白组的细胞存活率为1，HIF1有义siRNA组细胞存活率明显低于HIF1无义siRNA组和空白对照组，说明在缺氧环境中，HIF1对细胞增殖有调控作用. 3讨论 目前HIF1在细胞增殖和调亡中所起的作用仍存在争议.有研究报道HIF1抑制凋亡，促进增殖，促进肿瘤发生4.HIF1体内、体外转染均可促进肺癌A549细胞的生长，其机制与其能促进

14、细胞恶性增殖和抑制凋亡有关5.而另一方面，也有报道证实HIF1能稳定p53，从而促进细胞凋亡6.不同的研究结果提示HIF1可能在不同的细胞系中分别发挥促进或抑制凋亡的作用.本研究结果表明HIF1RNA干扰对SW480细胞的增殖有抑制作用，提示在人结肠癌细胞中HIF1有促进细胞增殖的作用. 血管内皮生长因子（VEGF）是HIF1的下游调控基因，当细胞处于缺氧环境时，HIF1表达迅速上升，与靶基因如VEGF基因的启动子或增强子区域相结合，诱导其表达.VEGF是目前已知作用最强的血管形成促进因子，作为旁分泌因子增加微血管通透性，诱导内皮细胞分裂、增殖、迁移，而促进血管形成7.另一方面有研究表明VEG

15、F不仅作为旁分泌因子刺激血管内皮细胞增殖，同时还作为自分泌因子直接作用于肿瘤细胞自身的VEGF受体而促进肿瘤细胞生长8.而针对VEGF的RNA干扰能有效抑制人卵巢癌细胞的增殖8. 我们的实验结果显示:构建的HIF1siRNA表达载体能有效抑制其mRNA和蛋白质的表达；当HIF1表达被抑制后，VEGFmRNA和蛋白质的表达随之明显下调；HIF1表达被抑制后，SW480细胞的增殖有一定程度的抑制，这种抑制有可能与VEGF表达下调有关.我们的研究结果显示,针对HIF1的RNA干扰能有效抑制SW480细胞的增殖和VEGF的表达，提示HIF1作为肿瘤缺氧应答中心因子，在结肠癌基因治疗中是一个有效的靶点，

16、RNA干扰技术有较好的应用前景. 【参考文献】 1ZagórskaA,DulakJ.HIF1:TheknownsandunknownsofhypoxiasensingJ.ActaBiochemiPol,2004,51(3):563-585. 2MizukamiY,LiJ,ZhangX,etal.Hypoxiainduciblefactor1independentregulationofvascularendothelialgrowthfactorbyhypoxiaincoloncancerJ.CancerRes,2004,64(5):1765-1772. 3YamakawaM,Liu

17、LX,DateT,etal.Hypoxiainduciblefactor1mediatesactivationofculturedvascularendothelialcellsbyinducingmultipleangiogenicJ.CircRes,2003,93(7):664-673. 4VaupelP.TheroleofhypoxiainducedfactorsintumorprogressionJ.Oncologist,2004,9(Suppl5):10-17. 5PiretJP,MinetE,CosseJP,etal.Hypoxiainduciblefactor1dependentoverexpressionofmyeloidcellfactor1protectshypoxiccellsagainsttertbutylhydroperoxideinducedapoptosisJ.BiolChem,2005,280(10):9336-9344. 6SowterHM,RatcliffePJ,WatsonP,etal.1HIF1dependentregulationofhypoxicinductionof