iNOS抑制剂对兔关节软骨修复组织胶原表达的影响

1、iNOS抑制剂对兔关节软骨修复组织胶原表达的影响 作者：孙炜 王吉兴 金大地 刘晓霞 刘安庆【摘要】 目的 观察诱导型一氧化氮合酶抑制剂对关节软骨修复组织胶原表达的影响。方法 24只新西兰大白兔双侧股骨髁间关节面造成全层软骨缺损。随机抽签均分为对照组、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)组和一氧化氮合酶抑制剂S²甲基异硫脲组(S²methylisothiourea，SMT)组。术后1年处死动物。应用苦味酸²天狼猩红染色检测胶原的分布情况，图像分析技术定量胶原的表达及进行修复组织软骨厚度的测量。应用免

2、疫组织化学技术检测型胶原的表达和分布。结果 图像分析显示，1年后SMT组型胶原表达量为65.9，明显少于BMP组88.5和对照组94.6的表达量，型胶原30.7的表达量明显多于BMP组10.8和对照组4.5的表达量。1年后SMT组软骨厚度(1.85±0.56) mm明显高于BMP组(0.67±0.31) mm和对照组(0.24±0.10) mm。SMT组缺损区型胶原含量明显高于BMP组和对照组。结论 iNOS抑制剂SMT的应用能明显增加型胶原表达和软骨厚度，对于维持软骨表型有积极意义。 【关键词】 一氧化氮酶 抑制剂 软骨 S²甲基异硫脲 胶原

3、Abstract：Objective To discuss effect of collagen expression in articular cartilage repaire tissue by inducible nitric oxide synthase inhibitor SMT.Methods Full²thickness defects of cartilage were created in the trochlear groove of twenty²four adult New Zealand White rabbits.eight d

4、efects were empty，eight were filled with a collagen fibrin glue impregnated with rhBMP，eight were filled with a collagen fibrin glue impregnated with rhBMP and hypodermic injection with 5 mg/kg²1/12 h²1 SMT.The animals were killed at one²year postperatively.The tissue sect

5、ions were stained with Sirius²Red against collagen type²and type²which analyzed by Quantiment 500.Cartilage thickness was measured by Quantiment 500 too.Results One²year after collagen fibrin glue with rhBMP and with hypodermic injection SMT，collagen type&sup2

6、; expression of repair tissue in SMT group(65.9) was less than in BMP group(88.5) and the control(94.6)，and collagen type² (30.7) was more than in BMP group(10.8) and the control(4.5).Cartilage thickness of SMT group(1.85±0.56) mm was significant higher than BMP group(0.67±0.31) m

7、m and the control(0.24±0.10) mm.Conclusion NOS inhibitor SMT could increase collagen type²expression and decrease collagen type²expression，as well as make phenotype good. Key words：nitric oxide synthase；inhibitor；cartilage；s²methylisothiourea；collagen 一氧化氮(nitric oxid

8、e，NO)是活泼的自由基分子，参与多种组织的代谢调节。关节软骨自身修复能力十分有限，关节软骨损伤通常会导致更严重的关节软骨退变，既往研究已采用多种方法来修复和重建关节软骨，许多技术已被广泛应用于临床。而一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS) 抑制剂有助于软骨组织修复。因此本文应用苦味酸²天狼猩红染色，研究软骨修复组织中胶原纤维的表达变化，了解NOS抑制剂对软骨修复组织胶原表达的影响。 1 材料与方法 1.1 研究对象与实验分组 实验于1999年6月至2001年2月在南方医科大学完成。取8个月龄新西兰兔24只，雄性，体重(2.5±0.2)

9、kg。随机抽签法分为对照组、骨形态发生蛋白组(bone morphogentic protein，BMP)和诱导型一氧化氮合酶抑制剂S²甲基异硫脲(S²methylisothiourea，SMT)组，动物由南方医科大学提供。 动物模型和标本处理：8月龄新西兰兔24只，随机分为对照组、BMP组和SMT各8只。在右侧股骨髁间关节面上作直径4.5 mm、深达髓腔的全层缺损。a)对照组：软骨缺损不充填任何物质；b)BMP组：缺损用BMP纤维蛋白凝胶复合物充填；c)SMT组：缺损应用胶原复合BMP充填，术后按5 mg·kg1·12 h1皮下注射SM

10、T。术后1年各组处死动物，制作石蜡切片用于检测。 1.2 苦味酸²天狼猩红染色显示胶原分布：石蜡切片，0.1的天狼猩红饱和苦味酸溶液(0.1 g天狼猩红溶于100 mL苦味酸溶液)染60 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。偏振光显微镜下观察。 1.3 软骨、型胶原图像分析 在40倍视野下，每张切片上选择10个纵向视野，以正常软骨、型胶原色度为参照。利用LeicaQ500MC图像分析仪，在交互式操作方式下进行测试，获得关于胶原的体视学定量指标。将获得的体视学参数值按体视学原理和计算公式求得每例标本的形态学定量参数值，得到各型胶原含量。软骨厚度图像分析：利用LeicaQ50

11、0MC图像分析仪，100倍视野下测量修复组织表面型胶原显示的厚度来间接测量软骨厚度。 1.4 统计学分析 SPSS 8.0软件包完成统计处理，数值均以±s表示，Paired²samples T test作均数的显著性检验。 2 结 果 2.1 偏振光显微镜下观察 在偏振光显微镜下，型胶原表现为较强的双折光，紧密排列，为黄色或红色的纤维。型胶原显示弱的双折光，呈现绿色混合颜色的疏松纤维。术后1年，对照组修复组织内基本未见绿色纤维，以致密粗大黄色纤维为主，与软骨下骨结构也有明显差别；术后1年，BMP组基本以黄色和红色纤维为主，中间夹杂很少量绿色弱折光纤维；术后1年，SM

12、T组仍可见大量绿色弱折光纤维，但局部有异位骨化。 2.2 软骨修复组织/胶原分布图像分析结果 经图像分析，SMT组术后1年型胶原占65.9，型胶原30.7。分别与对照组型胶原(94.6)、BMP组型胶原(88.5)，对照组型胶原(4.5)、BMP组的型胶原(10.8)相比，差异有显著性意义(P0.05)(见表1)。表1术后1年软骨修复组织、胶原分布和厚度比较注：与对照组和BMP组相比，*P0.05。 2.3 软骨厚度的测量 经图像分析，1年后SMT组软骨厚度(1.85±0.56) mm明显高于BMP组(0.67±0.31) mm及对照组(0.24±0.10) mm

13、，其差异有显著性意义(P0.05)(见表1)。 3 讨 论 NO作为体内重要的信号传导分子，已证实在骨关节炎发病和转归方面有重要作用。我们以前的研究也提示iNOS抑制剂SMT能提高软骨修复组织的质量1，2，但由于技术的原因，均未能对软骨修复组织内胶原变化，特别是型和型胶原作定量分析，以阐明修复组织胶原的变化规律，从而提高修复组织质量。天狼猩红是阴离子强酸染料，易与胶原纤维中的碱性基团反应。胶原纤维在偏振光下有正的单轴双折光属性，与天狼猩红结合可增强双折射，提高分辨率3。Junqueira等4最早将苦味酸²天狼猩红染色法应用于组织切片的胶原检测，国内也曾用于纤维表达等方面的研究

14、5，6。 既往研究虽然采用了多种方法促进软骨修复，许多报告均能在早期获得缺损区透明软骨的生成。但是这些修复组织无论是在生物学结构和形态方面，还是生物力学方面，均与正常软骨不同。而且这些修复软骨组织较差的功能及耐用性，随后导致退行性退变，被纤维组织代替7、8。型胶原是软骨组织最主要的成分，可作为软骨的表型标记，决定了关节软骨特性，是评价软骨修复质量的标志之一。既往采用免疫组化技术不仅抗体来源不易，价格昂贵，操作费时，而且只能在不同切片上观察胶原的分布情况。而苦味酸²天狼猩红染色法可以在一张切片上同时显示出各种胶原的分布及其相互的关系，有利于观察软骨修复过程中各种胶原变化的规律。

15、随着计算机分析技术的成熟，根据不同的颜色和灰度定量分析胶原分布成为可能。我们首次采用苦味酸²天狼猩红染色法并与病理体视学方法结合，检测软骨修复组织中型和型胶原的分布，以观察一氧化氮合酶抑制剂SMT对软骨表型维持的影响。但天狼猩红染色对于区分型和型胶原尚不理想，我们采用正常软骨的型胶原为基准来校正软骨修复组织中型胶原，以此区分型胶原。同时，软骨修复中型胶原的表达较少。图像分析结果显示，SMT组软骨修复组织在术后1年型胶原明显少于BMP组和对照组，型胶原多于BMP组和对照组。 本实验结果提示，SMT的应用对维持软骨修复组织的表型方面具有积极作用。但软骨的修复组织与正常软骨相比仍然

16、有一定差距，尤其是异位骨化及接合处的退变。但苦味酸²天狼猩红染色法无疑是一种观察软骨修复组织中胶原类型、分布、含量及变化较理想的方法。【参考文献】 1Vuolteenaho K，Moilanen T，Knowles RG，et al.The role of nitric oxide in osteoarthritisJ.Scand J Rheumatol，2007，36(4)：247²58.2孙炜，王吉兴，金大地，等.一氧化氮合酶抑制剂长期作用对兔关节软骨缺损修复的影响J.中华医学杂志，2002，82(1)：23²26.3周明芳，程天民，冯

17、正直.抑郁对大鼠创面愈合过程中胶原含量的影响J.第三军医大学学报，2008，30(13)：1293²1295.4Junqueira LC，Cossermlli W，Brentani R.Differential staining of collagens of type ， and by Sirius Red and polarization microscopyJ.Arch HistolJpn，1978，41(3)：267²274.5姬文婕，周欣，杨磊.天狼猩红²偏振光法观察染石英小鼠肺组织胶原纤维的动态变化J.中华劳动卫生职业病杂志，2004，22(5)：361²363.6韩晓梅，赵堪兴.人眼直肌Pulley系统胶原成分的实验研究J.眼科新进展，2007，27(10)：721²724.7Peterson L，Brittberg M，Kiviranta I，et al.Autolo