丝裂霉素对人胃癌细胞谷胱甘肽转移酶表达的影响

1、丝裂霉素对人胃癌细胞谷胱甘肽转移酶表达的影响 作者：李海峰 程琳 乔振江 常宝【摘要】 目的：探讨丝裂霉素对胃癌细胞谷胱甘肽转移酶（Glutathione Strans ferase,GST）表达的影响。方法：利用人胃癌细胞株BGC823进行培养，加入丝裂霉素后5h和10h后采集细胞，进行免疫组化染色。结果：5h组，胞质中GST含量下降，胞核中GST增多；10h组其胞质与胞核中仍有少量GST表达。结论：丝裂霉素对BGC823癌细胞有明显的杀伤作用，其途径之一可能与抑制GST基因表达有关。【关键词】 丝裂霉素；胃癌；谷胱甘肽转移酶；免疫组织化学【ABSTRACT】 Objective：To st

2、udy the killing function of mitomycin on gastric cancer cells and the expression of GST . Methods: As human gastric cancer cells were cultured, mitomycin were injected to culture continuously for 5h or 10h. The gastric cancer cells were observed under optical microscope and transmission electron mic

3、roscope after staining with immunohistochemical method.Results: The morphology of gastric cancer cell was not changed significantly, but content of GST decreased in the 5 hours group in the group. The changes in the 10 hours group were as follows: the cell organ were obviously destroyed, the cell me

4、mbrane were burst, the expression of GST was little in cytoplasm and nuclear. Conclusion:Mitomyclin has a killing fuction to gastric cancer cells, one of manners was related to restraining the expression of GST gene.【KEY WORDS】 Mitomycin;Gastric cancer;GST;Immunohistochemical method 化学治疗是对恶性肿瘤综合性治疗的

5、一部分，丝裂霉素是临床常用的抗癌药之一，其作用效果临床已有报告，而对其作用途径，尤其是它对重要酶系的影响，尚未见报告。本实验采用细胞培养技术和免疫组织化学技术，观察丝裂霉素（Mitomycin,MMC）对胃癌细胞谷胱甘肽转移酶（胎盘型，简称GST）的影响，为探讨丝裂霉素的抗癌机制提供科学依据。1 材料和方法11 材料 丝裂霉素注射液（Mitomycin for injection）由浙江省海正药业股份有限公司生产（批号040901）。BGC823胃癌细胞株由北京肿瘤研究所提供；二氧化碳培养箱和RPMI1640培养液由实验中心提供。兔抗人GST抗血清及SP试剂盒由北京中山生物技术公司提供。12

6、方法 将5×104浓度的BCG823细胞接种于无菌96孔板和6孔板中，培养24h。在6孔板中加入无菌盖玻片，使癌细胞附壁生长（爬片）。对照组不加入药物，实验5h组，即加入MMC15l(00075mg),培养5h后收获，实验10h组则加药后培养10h。然后将培养液中细胞离心，25%戊二醛前固定。将附壁爬片的癌细胞培养液中分别加药5h、10h后取出盖片，用4%多聚甲醛固定，常规洗涤和SP免疫组织化学染色。其操作程序按试剂盒说明书进行。阴性对照PBS代替抗，阳性对照为已知人胃癌组织切片。13 统计学处理 利用彩色图象分析仪软件进行图象分析。每组随机计数100个癌细胞，以灰度表示着色深浅（深

7、者灰度值低，浅者灰度值高）。借助SPSS软件进行方差分析，然后进行独立样本t检验。2 结果免疫组化染色，GST阳性物质呈棕黄色或黄色，分布在癌细胞质或少数细胞的核与质中，用药5h组胞核与胞质阳性物质均减少（见表1），其灰度升高（表示着色浅），并与对照组有显著性差异（P<001）。10h组生存细胞减少，只有生命力强代谢旺盛的部分细胞仍存活，所以这些细胞仍含GST，但是与对照组相比含量减少。表1 丝裂霉素对胃癌细胞GST表达灰度的影响（略）注：与对照组比较有显著性差异（P<001）3 讨论丝裂霉素（Mitomycin或Mutamycin,MMC）是抗癌抗生素类药物，是由

8、轮生链霉菌培养液中提取的有效成分，其分子为C15H18N4O51。临床上用于胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌和肠癌等化学治疗。为细胞周期非特异性药物，对G1晚期和S早期细胞更为敏感。本药进入体内在还原酶的作用下或体外其它途径作用下发生活化，活化后MMC才能够和DNA交叉联结或断链反应，改变DNA分子中的信息密码，从而抑制DNA复制，同时对RNA和蛋白质合成也有一定抑制作用2，3。本实验观察MMC对GST基因表达的干扰作用主要是因为GST是一种具有多种生理功能的蛋白质，具有过氧化物酶和异物酶特性3，4，其主要功能：它能够催化机体内有害物特性化合物与谷胱甘肽相结合；它可以由非酶结合方式将体内各种潜在毒性化

9、合物、致癌剂及亲脂性化合物从体内排除，从而达到解毒功能；参与机体抗氧化和保护细胞内许多物质合成、存储和运转过程，如：对某些激素和胆红素转运和结合等。抑制丝原活化蛋白激酶和细胞外信号调节激酶活性，从而阻断细胞凋亡途径5。机体受到外源性刺激诱导细胞癌变的过程中，GST也是呈高表达现象，如过去我们曾检测胃、肠癌，食道癌和乳腺癌时发现68，正常胃肠、食道和乳腺组织GST是低表达状态，癌变后GST在癌组织中是呈高表达现象，GST在上述癌组织中阳性率分别为：大肠癌684%、乳腺癌6170%、胃癌625%。本实验表明BGC823胃癌细胞中GST也呈阳性表达，对照组细胞质着色深度略低于细胞核着色深度（见表1，

10、色浅者数值大），丝裂霉素作用5h其胞浆中含量明显降低，而细胞核中着色明显加深（灰度值降低）并与对照组有明显差异(P<001)；说明药物刺激5h癌细胞应激反应，而GST基因激活、编码GST蛋白速度加快（合成旺盛）;10h细胞质与胞核GST含量减少。另一方面也可能因为MMC加入培养液5h尚未被完全激活之故。而药物作用10h，造成癌细胞器损伤，更由于MMC与DNA交联，使多种DNA、RNA被抑制，其中GST基因也同样被抑制（或破坏），所以GST含量明显下降。本实验提示MMC对BGC823癌细胞的杀伤作用，5h对细胞影响尚不明显，GST合成旺盛；10h时开始有明显的形态变化，细胞器和细胞

11、核破坏，GST含量明显下降，细胞解毒功能受阻，进而加速了癌细胞的解体。参考文献1 倪韶青,寿洪初,赵正言，等.谷胱甘肽硫转移酶与疾病和化疗J.中国药学杂志,2005,40(20):153015332 杨海灵,聂力嘉,朱圣庚，等.谷胱甘肽硫转移酶结构与功能研究进展J.成都大学学报(自然科学版),2006,16(1):20233 Perez P,Teijeiro D,Marin D.Interactions of surface confined DNA with electroreduced Mitomycin CJ.ChemicoBiological Interactions, 1999,17:654 宋广杰，王贵生，薄爱华，等. 热休克蛋白和谷胱甘肽酶在胃肠癌中表达的研究J.中国临床医学杂志，2001，2（6）：135 殷志敏，刘爱华，姜勇.谷胱甘肽S转移酶通过抑制ASK1MKKJNK通道保护血清撤离诱导的293细胞死亡J.生物化学与生物物理学报，2001,33（2）：1851906 郭汉斌，张新国，李建峰，等.GST在乳腺癌