人胆固醇酯转运蛋白的cDNA克隆原核表达及抗血清制备

1、人胆固醇酯转运蛋白的cDNA克隆、 原核表达及抗血清制备【摘要】 目的: 克隆人胆固醇酯转运蛋白（CETP） cDNA序列, 利用大肠杆菌表达人CETP, 制备兔抗人CETP的多克隆抗血清。方法: 采用RTPCR方法, 将人CETP基因克隆到pET30b(+)上, 构建CETP原核表达载体并转化大肠杆菌, IPTG诱导表达, 切胶纯化蛋白后免疫家兔, 制备CETP抗血清, 以ELISA、 Western blot、 细胞免疫荧光方法对抗血清效价及特异性进行鉴定。结果: SDSPAGE分析表明, 经IPTG诱导, CETP基因在大肠杆菌BL21(DE3)的包涵体中高效表达, 最佳诱导表达时间为4

2、 h。将切胶纯化的蛋白免疫家兔, ELISA法测定的抗血清效价为15.12×105。Western blot及细胞免疫荧光检测结果显示, 抗血清可以与CETP原核及真核表达蛋白特异结合。结论: 成功地将CETP进行了原核表达并制备了高效价、 高特异性的兔抗人CETP抗血清, 为进一步研究CETP的结构与功能奠定了基础。 【关键词】 胆固醇酯转运蛋白 原核表达 抗血清Abstract AIM: To clone human cholesteryl ester transfer protein (CETP) cDNA, express and purify human CETP in E

3、.coli and prepare CETPspecific rabbit antiserum. METHODS: by RTPCR method, the encoding sequence of human cholesteryl ester transfer protein (CETP) was cloned into pET30b(+) vector. Then BL21 (DE3) of E.coli transformed with recombinant vector pETCETP was induced to express CETP in high level by IPT

4、G. The expressed protein was purified from SDSpolyacrylamide gel, and the antiserum against CETP was raised in rabbit. The titer and specificity of rabbit antiserum were evaluated by ELISA, Western blot and immunofluorescence assay. RESULTS: The results of SDSPAGE showed that CETP was expressed in t

5、he form of inclusion bodies in BL21(DE3) and the best expression time was about 4 hours. The titer of the rabbit antiserum prepared with CETP purified from SDSPAGE was 15.12×105 and the antiserum reacted specifically with CETP expressed in BL21 (DE3) and COS7 cells. CONCLUSION: The preparation

6、of the specific rabbit antiserum against CETP will be valuable for the study on the structure and function of human CETP.Keywordscholesteryl ester transfer protein; prokaryotic expression; antiserum摘 要 目的: 克隆人胆固醇酯转运蛋白（CETP） cDNA序列, 利用大肠杆菌表达人CETP, 制备兔抗人CETP的多克隆抗血清。方法: 采用RTPCR方法, 将人CETP基因克隆到pET30b(+)上

7、, 构建CETP原核表达载体并转化大肠杆菌, IPTG诱导表达, 切胶纯化蛋白后免疫家兔, 制备CETP抗血清, 以ELISA、 Western blot、 细胞免疫荧光方法对抗血清效价及特异性进行鉴定。结果: SDSPAGE分析表明, 经IPTG诱导, CETP基因在大肠杆菌BL21(DE3)的包涵体中高效表达, 最佳诱导表达时间为4 h。将切胶纯化的蛋白免疫家兔, ELISA法测定的抗血清效价为15.12×105。Western blot及细胞免疫荧光检测结果显示, 抗血清可以与CETP原核及真核表达蛋白特异结合。结论: 成功地将CETP进行了原核表达并制备了高效价、 高特异性的

8、兔抗人CETP抗血清, 为进一步研究CETP的结构与功能奠定了基础。关键词胆固醇酯转运蛋白; 原核表达; 抗血清 人胆固醇转运蛋白（cholesteryl ester transfer protein, CETP）是一个极度疏水的糖蛋白, 包含476个氨基酸, 非极性氨基酸占45%1。在逆向胆固醇转运中, CETP促进胆固醇酯从高密度脂蛋白（HDL）转运到含载脂蛋白B（apoB）的脂蛋白颗粒中, 同时反向转运甘油三脂, 因参与了血浆脂蛋白胆固醇水平的调控和脂蛋白颗粒的重塑, CETP在脂蛋白代谢中的作用近年来倍受重视2。然而, 到目前为止, 尽管人们已经获得了几种CETP的抑制剂3, 但对CE

9、TP究竟是抗动脉粥样硬化(AS)因子还是致AS因子一直存在争议。在逆向胆固醇转运中, HDL颗粒内的胆固醇酯被CETP转运到含apoB的脂蛋白中, 随后, 这些脂蛋白被肝吸收分解, 由于促进了外周组织多余胆固醇向肝的运送, 避免了胆固醇在血管内的富集, CETP被认为是抗动脉粥样硬化的。然而, 另一方面, 这个过程直接导致了具有抗动脉粥样硬化作用的高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)水平的下降, 因此, CETP又被认为是促动脉粥样硬化的。大量的流行病学及动物研究显示, CETP抗动脉粥样硬化和促动脉粥样硬化特性之间可能存在内在平衡, 其确切功能依赖于代谢环境和遗传背景1。 我们在已发表的人CETP

10、 cDNA序列基础上, 通过RTPCR方法扩增得到CETP成熟蛋白编码序列并克隆到原核表达载体中, 化学诱导重组蛋白的高效表达, 并制备出相应的特异性抗血清, 为深入研究CETP在AS中的确切功能以及CETP蛋白水平的检测等奠定了基础。1 材料和方法1.1 材料人肝组织来自北京协和医院外科肝部分切除的手术标本。新西兰大耳白兔(雄性, 体质量2.53.0 kg)购自中国药品生物制品检定所。pET30b(+)质粒载体购自Novagen公司。BL21(DE3)菌株为本室冻存。限制性内切酶及pyrobest DNA聚合酶等工具酶购自TaKaRa公司。SuperScript FirstStrand Sy

11、nthesis System for RTPCR及pcDNA3.1/mycHis(-)A质粒购自Invitrogen公司。弗氏完全佐剂、不完全佐剂和DMEM培养基购自Gibco公司。蛋白标准购自Fermentas公司。COS7细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。高效真核转染试剂盒购自威格拉斯仪器有限公司。BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司。ECL化学发光试剂盒及HRP和FITC标记的山羊抗兔二抗购自Santa Cruze公司。1.2 方法1.2.1 CETP cDNA克隆提取人肝组织总RNA并纯化mRNA, 将mRNA反转录成cDNA, 根据参考文献4中的人CETP cDNA序

12、列设计引物: 5GGAATTCCATATGTGCTCCAAAGGCACCTCGC3（含Nde I位点和起始密码子）; 5ACGCGTCGACGCTCAAGCTCTGGAGGAAATCCAC3（含Sal I位点和终止密码子）。用Pyrobest DNA polymerase进行PCR: 94 4 min; 94 1 min, 56 1 min, 72 3 min, 2 个循环; 94 1 min, 68 1 min, 72 3 min, 28 个循环, 最后72延伸10 min, 得到人CETP RTPCR产物, 用于后续实验。1.2.2 CETP原核表达载体pETCETP的构建将PCR产物电泳

13、回收后, 与pET30b(+)质粒同时进行Nde 和Sal I双酶切。将酶切后的PCR产物与载体连接, 转化入大肠杆菌BL21（DE3）, 小量提取质粒进行PCR鉴定, 鉴定引物为: 5CCAGCAGCCAGGTGGAGC3, 5GGAGGTCCTCTGAGACATTCTTG3。将PCR鉴定为阳性的克隆送北京三博远志生物有限公司测序。1.2.3 重组蛋白的诱导表达将CETP原核表达载体pETCETP转化大肠杆菌BL21(DE3), 挑取单克隆进行IPTG诱导表达（1 mmol/L）, 收集菌体, 超声破碎, 离心, 分别将上清和沉淀进行SDSPAGE电泳分析, 确定CETP的表达形式, 之后将

14、CETP原核表达菌株分别诱导表达07 h, 超声破碎菌体后进行SDSPAGE电泳, 以确定最佳诱导表达时间。1.2.4 重组蛋白的纯化将pETCETP转化菌株进行大量诱导表达, 离心收菌, 超声破碎, 收集并洗涤包涵体, 用8 mol/L尿素溶解后进行SDSPAGE电泳分离。从胶的两边分别切一条胶, 于速染液中染色约10 min, 脱色。比照染色的两边胶条, 将未染色胶对应于目的蛋白的部分切下来, 捣碎。加入适量的TrisHCl buffer（10 mmol/L, pH8.0）, 4摇床上摇摆过夜。收集上清, SDSPAGE电泳鉴定蛋白纯度,定量后冻存于-20, 作为免疫原。1.2.5 兔抗C

15、ETP抗血清的制备用1 mg/kg抗原加等体积完全弗氏佐剂以背部皮内多点注射进行基础免疫, 2周后用0.5mg/kg抗原加不完全佐剂进行加强免疫, 以后间隔710d加强1次, 加强2次后取耳缘静脉血, 用间接ELISA法进行抗体效价检测。效价>14000时动脉放血, 43500 r/min离心10 min分离血清, 分装冻存于-20。1.2.6 抗血清效价的检测通过间接ELISA法测定了抗血清的效价。以纯化的CETP为抗原包被, 4过夜, 洗涤。加不同稀释度的待测抗血清, PBS为空白对照, 免疫前血清为阴性对照, 37 2 h, 洗涤。加HRP标记的羊抗兔二抗（11000稀释度

16、） 37 2 h, 洗涤。加新配制的OPD（邻苯二胺）底物溶液37 30 min, 加终止液, 用ELISA检测仪测定A490值, P/V>2.1, 即抗血清A值比阴性对照血清A值大2.1倍以上时为阳性。1.2.7 抗血清特异性的Western blot及细胞免疫荧光检测 将BL21(DE3)菌株、 转化pET30b(+)空质粒的菌株、 转化pETCETP质粒的菌株进行IPTG诱导表达, 收集菌体, 超声破碎, 收集并洗涤包涵体, 用8 mol/L尿素溶解后进行SDSPAGE电泳分离, 并转移至PVDF膜上, 依次加12000的兔抗血清（4孵育过夜, PBST洗膜3次, 每次10

17、 min）及15000的HRP标记的山羊抗兔二抗（室温孵育1 h, 洗膜同上）。然后用ECL化学发光试剂盒的试剂显影, 并在暗室中用X光片感光1 min5。 为了检测抗血清与真核表达CETP的反应性, 将CETP cDNA蛋白编码序列克隆入pcDNA3.1/mycHis(-)A载体中, 构建CETP真核表达载体pcDNA3.1CETP（方法同CETP原核表达载体构建）, 分别将pcDNA3.1CETP、 pcDNA3.1/mycHis(-)A质粒瞬时转染COS7细胞, 72 h后进行细胞免疫荧光检测, 一抗为本研究制备的兔抗人CETP多克隆抗血清, 二抗为FITC标记的山羊抗兔IgG6。2 结

18、果2.1 CETP cDNA克隆及其原核表达载体的构建人肝组织mRNA经RTPCR反应扩增出的PCR片段约为1500 bp, 与预计结果相符（图1）。 将PCR产物克隆入pET30b(+)质粒载体, 将重组质粒转化DH5, 挑取单菌落小量提取质粒进行PCR鉴定。鉴定结果显示, 以人肝cDNA及所选菌落的质粒为模板进行PCR扩增均得到1条约500 bp的片段, 与预计结果一致。将PCR鉴定为阳性的克隆送公司测序, 测序结果用NCBI的BLAST程序分析, 结果表明, 获得的CETP蛋白编码序列同GenBank中登录的序列一致, 且在原核表达载体中的连接方向和阅读框架正确。2.2 重组蛋白的诱导表

19、达与纯化 将pETCETP转化BL21（DE3）菌株, IPTG诱导表达3 h后, 将菌体超声破碎后所得上清和沉淀进行SDSPAGE电泳。在pETCETP转化菌株超声破碎后的沉淀中有1条Mr约53000的特异蛋白带, 该蛋白Mr与根据CETP cDNA蛋白编码序列所推导的蛋白Mr相符, 说明CETP能够在BL21（DE3）菌株中表达, 且在包涵体中表达（图2）。 将CETP原核表达菌株分别诱导表达07 h, 超声破碎菌体后收集包涵体进行SDSPAGE电泳, 确定最佳诱导表达时间。从图中可看出, 在诱导表达4 h后, CETP的表达量最大（图3）。 将CETP原核表达菌株进行大量诱导表达, 切胶

20、纯化目的蛋白, SDSPAGE电泳检测蛋白纯度。结果显示, 纯化回收的蛋白Mr只在约53000处有1条特异的蛋白带, 经Quantity One软件分析, 蛋白纯度达到了100%, 可以用作免疫原（图4）。2.3 抗血清的效价检测将纯化的CETP免疫家兔制备抗血清, 间接ELISA法检测效价, 结果表明, 兔抗人CETP抗血清的效价为15.12×105。2.4 抗血清的特异性鉴定采用Western blot检测抗血清与CETP原核表达蛋白的反应性, 结果表明(图5), CETP抗血清与转化pETCETP质粒菌株的包涵体蛋白反应, 产生一条Mr约为53000的清晰着色带, 而与其他对照

21、不发生反应, 由此可见, 所产生的抗血清可以与原核表达的CETP特异结合。通过细胞免疫荧光检测抗血清与CETP真核表达蛋白的反应性, 结果显示（图6）, 转染pcDNA3.1CETP重组质粒的COS7细胞质中出现绿色荧光, 而对照质粒pcDNA3.1/mycHis(-)A转染的细胞则没有, 说明本研究制备的兔抗人CETP抗血清可以与真核表达的CETP蛋白发生特异反应结合。3 讨论 为了得到特异性比较高的CETP抗血清, 我们克隆了人CETP cDNA成熟蛋白编码序列并进行了原核表达。结果显示, 人CETP的原核表达产物主要以不可溶的形式存在于大肠杆菌的包涵体中, 这可能与CETP蛋白Mr大且疏

22、水性氨基酸含量比较高有关。在CETP原核表达蛋白的纯化中, 首先使用镍离子柱进行了纯化, 经过条件优化后, 纯化的蛋白中仍有较多的杂蛋白（结果没有显示）, 所以最终采用了切胶纯化回收的方法。结果表明, 该法操作简便、 蛋白损失小, 纯化得到的蛋白纯度高, 完全符合制备抗血清的要求。纯化抗原免疫家兔后, 得到的抗血清效价很高, 且可以与CETP原核及真核表达蛋白发生特异反应, 说明我们得到的抗血清为CETP的特异性抗血清。 CETP是一个参与脂质代谢的重要蛋白,但其在AS中的确切功能还不清楚。除与AS密切相关外,CETP还和很多其他疾病如冠心病、 糖尿病、肾病等也密切相关。CETP与冠心病之间的

23、关系随代谢环境而定。当HDLC水平较低时, CETP活性与冠心病风险之间正相关, 当HDLC水平明显升高时, 不管CETP活性如何, 冠心病的风险都比较低7。糖尿病患者血清CETP活性明显高于健康人, 呈现动脉硬化性脂蛋白谱改变, 心脑血管疾病的危险性增加8。慢性肾脏疾病患者中, 血清CETP活性明显高于正常对照组, 常伴有脂质代谢异常, 并有较高的AS发病率9。尽管CETP与这些疾病的确切关系还在研究中, 但随着CETP功能的进一步阐明, CETP水平可能成为这些疾病预防和临床监测的重要指标。本研究中,我们获得了大量CETP原核表达蛋白及CETP特异性抗血清, 为进一步研究CETP在AS等疾

24、病中的确切功能及CETP水平的检测提供了有力的工具。【参考文献】 1 Sviridov D, Nestel PJ. Genetic factors affecting HDL levels, structure, metabolism and functionJ. Curr Opin Lipidol, 2007, 18(2): 157-163.2 Ohashi R, Mu H, Wang X, et al. Reverse cholesterol transport and cholesterol efflux in atherosclerosisJ. QJM, 2005, 98(12): 845-856.3 El Harchaoui K, van der Steeg WA, Stroes ES, et al. The role of CETP inhibition in dyslipidemiaJ. Curr Atheroscler Rep, 2007, 9