人高迁移率族B1蛋白原核表达纯化及抗体制备和初步应用

1、人高迁移率族B1蛋白原核表达、 纯化及抗体制备和初步应用 作者：田爽, 刘民, 李欣, 浦永, 吴海东, 汤华【摘要】 目的: 原核表达并纯化人高迁移率族B1蛋白(HMGB1)免疫日本大耳白兔制备其抗体。方法: 构建原核表达质粒pRsetA2HMGB1, 转化大肠杆菌BL21(DE3), HMGB1蛋白经异丙基D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。融合蛋白通过Ni2+NTA树脂亲和纯化后免疫兔子制备抗体血清。以间接ELISA法检测抗体效价, Western blot和免疫荧光染色鉴定抗体特异性。结果: 成功构建原核表达质粒, 表达并纯化HMGB1蛋白。ELISA检测抗体效价为116 000以上,

2、 Western blot和免疫荧光染色确定抗体具有高度特异性。结论: HMGB1蛋白和抗体的成功制备, 为下一步研究将HMGB1作为肿瘤等疾病治疗的新靶点奠定基础。 【关键词】 HMGB1; 原核表达; 抗体; 癌症 高迁移率族蛋白(HMG蛋白)因其相对分子质量小(Mr<30 000), 在聚丙烯酰胺凝胶电泳中快速迁移而被命名。人高迁移率族B1蛋白(high mobility group box 1, HMGB1)基因位于染色体l3q12, 它包括3个不同的功能区, N末端(A区和B区)富含带正电荷的赖氨酸, 而C末端(C区)富含带负电荷的天冬氨酸和谷氨酸1。HMGB1蛋白在胞

3、内外都有分布, 根据其分布不同而发挥不同的生物学效应。细胞核HMGB1参与构建核小体, 维持其稳定性, 同时在DNA重组、 复制、 修复和基因转录中起重要的辅助作用。细胞外HMGB1具有细胞因子特性, 它与细胞分化、 迁移、 增殖、 凋亡以及炎症反应的诱导等密切相关2, 而且在人类病理状态下如Alzheimers病、 败血症、 局部缺血再灌注损伤、 关节炎和癌症中, 都伴随着HMGB1蛋白的失调。尤其是在癌症包括乳腺癌、 结肠癌、 前列腺癌、 肺癌等中, HMGB1蛋白过表达与肿瘤的增殖和转移有关3。本研究中原核表达HMGB1蛋白、 纯化并制备其抗体, 为深入研究将HMGB1作为肿瘤等相关疾病

4、治疗的新靶点起到了基础性作用。 1 材料和方法 1.1 材料 人淋巴细胞RNA逆转录产物, 原核表达载体pRsetA2(由本实验室在pRsetA基础上改建而成, 将EcoR I和Xho I位点调换), 大肠杆菌XL1Blue、 BL21(DE3), 肿瘤细胞系均由本实验室保存。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成; Taq DNA聚合酶、 T4 DNA连接酶、 标准蛋白marker购自Ferments公司; 各种限制性内切酶购自TaKaRa公司; DNA marker、 日本大耳白兔、 抗GADPH抗体、 辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG购自赛尔生物科技有限公司; Ni2+NTA

5、Superflow层析纯化树脂购自Qiagen; 异硫氰酸(FITC)标记的驴抗兔IgG购自Jackson Immunoresearch Laboratories。其他所用化学试剂均为分析纯以上产品。 1.2 方法 1.2.1 引物设计及目的片段的扩增 根据NCBI基因库中HMGB1编码区序列以及原核表达载体pRsetA2上的多克隆位点, 通过Primer Premier5.0软件设计上下游特异性引物如下: 5GACGAATTCGCCACCATGGGCAAAGGAGATCCTAAG3(划线处为EcoR I酶切位点) 5GCTCACCTCGAGGCTTCATCATCATCATCTTCTTCTTC

6、ATC3(划线处为Xho I酶切位点)。以人淋巴细胞RNA逆转录产物为模板进行PCR, 扩增条件为: 94预变性4 min, 然后94变性1 min、 58退火1 min、 72延伸1 min, 共31个循环, 最后72延伸10 min。PCR产物经琼脂糖(10 g/L)凝胶电泳后, 由凝胶成像系统拍照并鉴定。 1.2.2 原核表达质粒的构建 PCR回收产物和pRsetA2空载体以EcoR I和Xho I双酶切, 37水浴过夜后, 进行琼脂糖(10 g/L)凝胶电泳并回收, 然后在T4 DNA连接酶作用下室温连接4 h, 转化E.coli XL1Blue, 通过氨苄青霉素(Amp+)抗性筛选得

7、到重组子。挑取阳性克隆小提质粒DNA并双酶切鉴定。 1.2.3 pRsetA26hisHMGB1融合蛋白的诱导表达 鉴定正确的质粒转化E.coli BL21(DE3), 涂布于Amp+抗性的LB平板37过夜培养。然后挑取单克隆于2 mL LB中, 37 230 r/min振荡培养过夜。次日按120比例接种培养物到10 mL新鲜的LB中, 37 230 r/min振荡培养约2 h, 直到A600=0.5-0.7。取1 mL作为诱导前对照, 其余的加入IPTG至终浓度为1 mmol/L, 30继续振荡培养4 h。然后5 000 g离心5 min, 去上清收集菌体, 加入Buffer B(100 m

8、mol/L NaH2PO4, 10 mmol/L Tris·Cl, 8 mol/L urea, pH8.0)重悬菌体后超声裂解, 10 000 g离心10 min留取上清。取部分上清加入上样缓冲液(含有100 mL/L 巯基乙醇)水浴煮沸5 min, 冰置待上样, 进行SDSPAGE电泳, 考马斯亮蓝染色分析。 1.2.4 融合蛋白的纯化 将表达融合蛋白的菌液转接到300 mL LB中扩大培养, 并按上述条件诱导表达和裂解菌体, 然后离心将上清液加到Ni2+NTA树脂中, 4旋转混匀30 min, 加入Buffer C(100 mmol/L NaH2PO4, 10 mmol/L Tr

9、is·Cl, 8 mol/L urea, pH6.3)洗涤柱床去除杂蛋白, 再加入Buffer D(100 mmol/L NaH2PO4, 10 mmol/L Tris·Cl, 8 mol/L urea, pH4.5)洗脱目的蛋白, 最后洗脱液经磷酸盐缓冲液(PBS)透析后-20保存。其中每一步流下的液体取部分上样进行SDSPAGE分析。 1.2.5 免疫兔子制备抗体血清 取200 g蛋白与弗氏完全佐剂按11比例混合后皮下注射初次免疫兔子, 以后每间隔2周, 取200 g蛋白与弗氏不完全佐剂按11比例混合加强免疫2次, 1周后兔耳缘静脉取血检测抗体效价并加强免疫1次, 如达

10、到所需效价值7 d后取全血。 1.2.6 间接ELISA法检测抗体效价 以终浓度为1 g/L的HMGB1蛋白包被ELISA反应孔, 一抗是作为空白对照的PBS、 阴性对照的免疫前兔血清以及倍比稀释的抗HMGB1抗体, 二抗为HRP羊抗兔IgG(120 000), 最后加入底物显色后, 用酶标仪测定A450的值。结果以实验组值-空白对照/阴性对照-空白对照2.5为阳性, 以出现阳性反应的最高稀释度作为抗体的效价。 1.2.7 Western blot和免疫荧光染色检测抗体特异性 (1)Western blot: SDSPAGE电泳后将蛋白电转(4, 恒流300 mA, 2 h)到硝酸纤维素膜(N

11、C)上, 然后将NC膜在含50 g/L脱脂奶粉的TBST中室温封闭2 h后, 加抗HMGB1抗体(1200)室温作用3 h, TBST洗去未结合一抗, 再加HRP羊抗兔IgG二抗(11 000)室温作用1 h, TBST洗去未结合二抗, 加底物反应3 min后暗室曝光并观察结果。(2)免疫荧光染色: 将细胞接种于14孔板中, 细胞密度为2 0004 000/孔, 37孵育过夜。24 h后加40 g/L多聚甲醛4作用30 min固定细胞, 再加入5 mL/L TritonX1004, 4透化处理20 min。然后加100 mL/L驴血清封闭1 h后, 加抗HMGB1抗体(150)4作用过夜。次日

12、加FITC驴抗兔IgG二抗(1200)4作用1 h, 再加DAPI 4染色5 min, 最后加封片剂, 荧光显微镜下观察并拍照。 2 结果 2.1 PCR扩增的目的片段 经特异性引物进行PCR扩增后, 琼脂糖凝胶电泳可得到644 bp的目的条带(图1)。 2.2 验证原核表达质粒 重组质粒pRsetA2HMGB1经EcoR I和Xho I双酶切后出现644 bp的目的条带(图2), 说明重组质粒构建成功。图2 pRsetA2HMGB1原核表达质粒的酶切鉴定 2.3 鉴定诱导表达的HMGB1蛋白 将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3), 以IPTG诱导蛋白表达, 表达产物经SDSPAGE电泳后

13、考马斯亮蓝染色在Mr约为30 000处可见一明显蛋白条带(图3)。且与预期蛋白大小相符, 由此确定HMGB1蛋白表达成功。 2.4 融合蛋白的纯化 融合蛋白经Ni2+NTA树脂亲和纯化后进行SDSPAGE, 结果显示目的蛋白得到了高度纯化, 纯度可达90%以上, 而且经标准蛋白BSA标化后浓度约为1 g/L(图4)。 2.5 抗体效价的检测 通过间接ELISA法进行检测后, 抗体效价可达到116 000, 而作为阴性对照的免疫前兔血清显色呈阴性。 2.6 抗体特异性的分析 (1)用纯化的HMGB1蛋白免疫兔子后得到兔抗人HMGB1抗体, Western blot分析显示此抗体可特异性与大肠杆菌

14、经IPTG诱导所产生的HMGB1蛋白结合, 与菌体其他成分无交叉反应(图5A)。(2)HMGB1蛋白在多种肿瘤中都有表达, 收集肿瘤细胞系前列腺癌PCM2B4、 肺癌A549、 乳腺癌MDMBA231和MCF7、 结肠癌SW620、 宫颈癌HeLa、 白血病Jurkat细胞裂解物, 采用Western blot检测发现在Mr约为30 000处出现目的条带, 与文献报道的蛋白大小相符5, 表明此抗体可特异性识别内源性HMGB1蛋白 (图5B)。(3)在MDMBA231和A549细胞中, 免疫荧光染色显示HMGB1蛋白存在于细胞质中, 说明此抗体具有结合天然抗原的能力(图6)。 3 讨论 HMGB

15、1蛋白是近几年发现的与肿瘤生长、 迁移、 侵袭密切相关的染色质蛋白, 而且相对正常组织来说, 它在多种肿瘤组织中是过表达的3。肿瘤细胞在侵袭转移期间HMGB1蛋白会与其配体晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)相互作用, 激活MAPK、 P38MAPK, JNK和P42/P44MAPK等信号通路, 继而引起基质金属蛋白酶MMP2和MMP9激活, 使细胞外基质降解促进肿瘤浸润和转移6。这表明如果人为阻断信号途径可能会抑制肿瘤的迁移, 而其中应用抗HMGB1抗体降低HMGB1水平是直接而有效的途径之一。最早应用抗

16、HMGB1抗体是在炎症反应实验中, 实验发现抗HMGB1多克隆抗体可使LPS致死量攻击的小鼠生存率由0升至70%, 并且随着抗体剂量的加大, 最终可达100%7。同时抗HMGB1多克隆抗体也可明显减轻关节炎症状、 改善体重下降和关节组织的病理改变8。新近研究也显示, 应用抗HMGB1抗体进行干预后, 对严重内毒素血症、 脓毒症、 关节炎以及内毒素诱导的急性肺损伤均有积极的治疗作用。即使抗HMGB1抗体应用时机较晚, 仍可显著改善动物症状和预后9。这些研究为抗HMGB1抗体应用于炎症、 肿瘤等相关疾病治疗提供了实践基础, 使抗体治疗成为可能。 利用基因工程技术表达外源蛋白选择合适的表达载体是至关

17、重要的。具有T7启动子的原核表达载体pRsetA2, 在未诱导前转录不启动, 蛋白不会泄漏表达, 不会影响宿主菌的生长。同时此载体N端带有6His, 即有利于纯化HMGB1融合蛋白, 又可增强免疫原性制备抗HMGB1抗体。本研究选用此载体成功构建了原核表达质粒pRsetA2HMGB1, 纯化HMGB1蛋白并制备了其抗体。经间接ELISA法检测该抗体效价可达116 000, Western blot和免疫荧光染色确定, 抗HMGB1抗体不仅可以和原核表达的HMGB1蛋白特异性结合, 而且也可与多种肿瘤细胞系中内源性的HMGB1蛋白特异性结合。这为更深入研究与HMGB1蛋白相关疾病创造了有利条件。

18、【参考文献】 1 Muller S, Scafidi P, Degryse B, et al. The double life of HMGB1 chromatin protein: architectural factor and extracellular signalJ. EMBO, 2001, 20(16): 4337-4340.2 吴佳捷, 姚志韬. HMGB1的肿瘤生物学效应J. 中国普通外科杂志, 2007, 16(6): 584-586.3 Ellerman JE, Brown CK, de Vera Michael, et al. Masquerader: high mobility group Box1 and cancerJ. Clin Cancer Res, 2007, 13(10): 2836-2848. 4 张迎春, 刘 莹, 杨金菊, 等. Clusterin抗原的表达、 抗体制备及其初步鉴定J. 细胞与分子免疫学杂志, 2008, 24(1): 45-48.5 Jaakko Parkkinen, Erkki Raulo, Jussi Merenmies. Amphoterin, the 30kDa protein in a family of HMG1type