木聚糖酶在大肠杆菌中的表达

1、嗜热内切木聚糖酶基因xyn10B 克隆及其在大肠杆菌中的表达 食品科学093谢江英2009016513自 Horflcoshi 于 1973 年首次报道了来自细菌中的木聚糖酶以来，国外科研工作者已分离出百余种不同微生物来源的木聚糖酶，并将其基因在各种宿主菌中得到活性表达。由于高产野生的微生物生产木聚糖酶时，释放出的产物较为复杂，往往产生大量的纤维素酶，导致在应用中产生不必要的麻烦。如在纸浆预漂白时，纤维素会被意外降解。并且这些酶的性质极为相近，分离纯化的成本较高，不利于木聚糖酶的推广使用，通过基因工程的方法来构建一些高效表达或胞外分泌的工程菌株，将有助于解决木聚糖酶的大量收集和纯化问题。我国对

2、木聚糖酶的研究最近十几年才开始，大多限于天然木聚糖酶高产菌株的筛选，木聚糖酶的分离、纯化及性质分析，仅克隆和表达了少数木聚糖酶基因，而运用基因工程手段产业化生产木聚糖酶制剂在国内还刚刚起步。本研究从Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725 分离出木聚糖酶基因 xyn10B，连接于表达载体 pET-28a（+）的 Nco和 Xho酶切位点之间，构建重组表达质粒pET28a-xyn10B，转化大肠杆菌 E.coli BL21（DE3）codon plus-RIL，构建基因工程菌，实现木聚糖酶高效表达。1 实验材料1.1 菌株和质粒（1）热解纤维素菌Caldicell

3、ulosiruptor bescii DSM 6725； （2）质粒 pET-28a；（3）大肠杆菌 E.coli BL21（DE3）codonplus-RIL；1.2 实验材料及主要试剂抗生素氨苄青霉素，卡那霉素 试剂胰化蛋白胨、酵母提取物、琼脂糖；PCR引物合成；DNA测序；不同来源底物；其他常用化学试剂。 工具酶限制性内切酶Nco I、Xho I、T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、DNA Marker（DL2000 DNA Marker和-Hind digest DNA Marker）。 试剂盒PCR产物回收试剂盒，质粒小提试剂盒，细菌基因组提取试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，Ni-

4、柱纯化柱料。2.培养基及主要试剂配制（1）TAE buffer：核酸电泳缓冲液Tris-乙酸 0.04 mol/LEDTA 0.001 mol/L（2）5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：Tris碱 15.1 g甘氨酸 94 gSDS 5 g去离子水补齐至1000ml。（3）考马斯亮蓝染色液配方甲醇/水（1 :1，v/v） 90 ml冰醋酸 10 ml考马斯亮蓝R250 0.25 g应用What man1号滤纸过滤，除去杂质，室温；备用。（4）考马斯亮蓝脱色液乙醇 100mL乙酸 50mL蒸馏水定容至1L。（5）8×bindingbuffer（连接缓冲液）NaCl 4 MTri

5、s-HCl（pH 7.9） 160 mM（6）8×charge bufferNiSO4 800 mM（7）8×washbuffer（洗涤缓冲液）咪唑 800 mMNaCl 4 MTris-HCl（pH 7.9） 160 mM（8）4×strip bufferEDTA 400 mMNaCl 2 MTris-HCl（pH 7.9） 80 mM（9）蛋白质 SDS-PAGE 凝胶的配制溶液成分 分离胶 12%（5mL） 浓缩胶 5%（2mL）H2O 1.6 1.430%丙烯酰胺溶液 2.0 0.331.5mol/L Tris-HCl（pH8.8） 1.3 -1.0mol

6、/L Tris-HCl（pH6.8） - 0.2510%SDS 0.05 0.0210%过硫酸铵 0.05 0.02TEMED 0.005 0.002（10）宽范围缓冲液乙酸 100mMN-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPS） 100mMN-三（羟甲基）甲基-3-氨基丙磺酸（TAPS） 100mM3-环已胺基丙磺酸（CAPS） 100mM2-码啉乙磺酸（MES） 100mM分别在60，70下精确配制100mM不同pH的缓冲液，使用1M NaOH调节至所需的pH值。3.实验仪器振荡培养箱、无菌操作台、0.22m无菌滤器、冷冻高速离心机、2550 紫外分光光度计、Gene pulser Xc

7、ell、实验室水纯化系统、超滤管 Ultrafreet-MC 10kDa、垂直电泳仪、无油真空抽滤仪、AKTA prime plus 蛋白层析仪、聚合酶链式反应器 .Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725 的液体培养按照 DSMZ 的配方，配置厌氧培养基，分装于厌氧试管中，每管 5ml，培养基封闭后用真空泵将试管中的空气抽干，并充入一定量的氮气和二氧化碳的混合气体（80%N2和 20%CO2）。在厌氧箱中用培养基1m溶解购买于 DSMZ的 Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725，按照 1%的接菌量接种于5ml 试管中，混匀，7

8、5静置培养数天，直至细菌开始生长起来。然后转移至装有100ml培养基的锥形瓶中 75培养数天，-80保存菌体备用。.基因组 DNA 的提取取5ml小试管培养的 Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725，用细菌基因组 DNA 小量提取试剂盒提取细菌的基因组，所得染色体 DNA 溶液放 4冰箱备用。. Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725 xyn10B 基因的序列分析.Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725 xyn10B 基因的克隆以嗜热细菌 Caldicellulosiruptor bescii

9、 DSM 6725 xyn10B的基因组 DNA为模板 ，通过上游引物和下游引物进行嗜热木聚糖酶基因（xyn10B）的扩增。上游引物：5CCAGTCCCATGGAGAGCGAAGATTATTATGAAAA 3，划线部分为 Nco酶切位点；下游引物：5CGACGACTCGAGAAAGTCAATTATTCTGAAAAATGCC 3，划线部分为 Xho酶切位点；xyn10B 基因全长 1014bp，在 50 ul PCR 反应体系中，以基因组 DNA 第一链为模板，在无菌微量离心管中依次加入下述试剂（表 2-1）。轻轻混匀后迅速离心，95预变性3 min，94变性30s，60退火30s，72，延伸

10、90s，进行32个循环，然后 72延伸 20min，4保存。PCR 完成后，取 2u1扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，ChampGel 1000 型凝胶成像系统中进行图像采集与分析。通过 PCR 发现在退火温度梯度 50-60内都有产物，其中 55产物的浓度及纯度最好（图 2-3），电泳结果表明 PCR 产物与理论长度相符。PCR 产物使用 PCR 清洁试剂盒回收，双酶切后电泳鉴定并估计浓度，-20保存，备用。.载体制备及重组质粒的构建使用 Nco和 Xho酶切质粒载体pET-28a，去磷酸化后使用 PCR 产物纯化试剂盒回收，电泳鉴定并估计浓度，-20保存，备用。xyn10B 与 pET-28a

11、 连接反应，将下列试剂加入标记的无菌微量离心管中（表 2-4）。加完试剂，轻轻混匀后迅速离心，16孵育 2 h；4水浴中过夜连接。通过目的基因与载体的连接，构建重组表达质粒，构建的流程如图2-4 所示。.重组质粒转化大肠杆菌及阳性转化子的筛选通过 PCR 方法鉴定随机挑取的 10 个重组子，将经过 PCR 鉴定的阳性重组子基因进行测序，经测序确认序列完全正确，证明 xyn10B 基因克隆成功。提取阳性质粒，转化到表达宿主大肠杆菌中，并表达目标蛋白。.重组蛋白的诱导表达、鉴定以及纯化以 pET-28a 为载体，大肠杆菌为宿主细胞菌进行优化表达。将重组菌按 1%接种量接种于 5ml 含 100g/

12、ml 卡那霉素的2YT 培养基，在 37下震荡培养过夜。然后按 1%的接种量转接 1000ml 2YT 培养基，37震荡培养至OD600达到 1.0 左右时，加入诱导剂 IPTG至终浓度 1mM，27诱导 18-24h后，在 5000rpm 离心 20min 收集菌体，菌体重悬于6倍体积 50mMTris-HCl（pH8.0）缓冲液中，超声破碎后离心得到可溶性的上清组分和沉淀组分。上清组分 56热处理 20 分钟后离心即得粗酶液；SDS-PAGE 结果显示（图2-5），在预测的 xyn10B 理论分子量（40.2kDa）处出现一条明显的蛋白条带，占总蛋白量约 50%，说明目的蛋白表达成功。将粗

13、酶液进行 Ni 柱纯化，由于粗酶本身的纯度就很高，尤其上清组分纯度能达到 80%以上，所以经过一步 Ni 柱处理后就能得到 95%以上纯度的目的蛋白（图 2-5），可以用于各种酶学性质表征等实验。纯化过程中，在 pH7.2，温度 56条件下，以 Beechhood xylan 为底物测定不同处理后的酶活力以及相应的蛋白浓度，得到不同处理后的蛋白纯化表（如表2-5）。由图和表格知，经过热失活和亲和层析，几乎不含有任何杂蛋白，在SDS-PAGE 上呈现出清晰的单一条带，酶蛋白的纯化倍数为 2.47 倍，酶蛋白的回收率高达 79.2%，重组嗜热木聚糖酶 xyn10B 的蛋白分泌量高达 1370mg/ml。纯酶调整蛋白浓度为 10mg/ml 左右后，-20保存备用。参考文献：1田东升.嗜热内切木聚糖酶的克隆、表达