木犀草素对骨肉瘤的抑制效应及其机制研究

1、木犀草素对骨肉瘤的抑制效应及其机制研究【摘要】目的：研究木犀草素对骨肉瘤的抑制效应及其机制；方法：以1.25g/L、2.5g/L、5g/L、10g/L的木犀草素溶液对骨肉瘤MG-63细胞行划痕实验、侵袭实验、免疫印迹实验，并观察经不同浓度木犀草素溶液培养后骨肉瘤MG-63细胞形态；结果：木犀草素对于骨肉瘤MG-63细胞的生长、增值、运动迁移能力、穿膜细胞数量、IL-6蛋白表达水平均有一定的抑制作用，并且其抑制作用随着木犀草素浓度的增加而逐渐增加；结论：一定浓度的木犀草素对于骨肉瘤MG-63细胞具有极强的抑制作用，值得应用于临床骨肉瘤的治疗。【关键词】木犀草素；骨肉瘤；抑制效应；机制the me

2、chanism of inhibitory effect of luteolin on osteosarcomaAbstract Objective: inhibitory effect on human osteosarcoma and its mechanism of luteolin; methods: 1.25g/L、2.5g/L、5g/L、10g/L luteolin solution on osteosarcoma MG-63 cell line scratch test, invasion assay, Western blot, and observe the differen

3、t concentration of mignonette fibroin solution cultured osteosarcoma MG-63 cell morphology; results: luteolin for osteosarcoma MG-63 cell growth, proliferation, movement ability, transmembrane cell number, the expression level of IL-6 protein was inhibited, and the inhibition increased with the incr

4、ease of luteolin concentration increases gradually; conclusion: a certain concentration of luteolin has a strong inhibitory effect on human osteosarcoma MG-63 cells, treatment is applied to clinical osteosarcoma.keyword luteolin; osteosarcoma; inhibitory effect; mechanism骨肉瘤是临床相对常见的恶性肿瘤，多发于少儿或青少年，该病

5、预后不良，相当多的患者因患上该病而死亡1。近几年来，随着保肢手术的不断发展以及全新化疗药物的研制成功，骨肉瘤的治疗疗效有了较大的提高。但是，转移以及复发的骨肉瘤患者预后依然相当差，并且继发转移以及耐化疗药物骨肉瘤的出现仍然是相当严重的问题2。作为来源于植物的黄酮类物质，木犀草素能够干扰骨肉瘤细胞新陈代谢的正常进行，抑制其生长，诱导其凋亡，对于骨肉瘤的治疗具有较高的应用价值3、4。为研究木犀草素对骨肉瘤的抑制效应及其机制，为临床治疗骨肉瘤提供依据，我院于2013年6月2014年5月展开相关研究，其效果显著，现作如下总结报道。1 材料与方法1.1 材料细胞系：选择浙江大学药学院培养的人体骨肉瘤MG

6、-63细胞系。药物：木犀草素（Sigma公司产品）试剂：小牛血清（GIBCO公司产品），RPM1640培养基粉剂（GIBCO公司产品），胰蛋白酶（Amersco公司产品），-actin抗体（Sigma公司产品），IL-6（Sigma公司产品），辣根过氧化物酶标记二抗（Jackson公司产品）。仪器： 通用台式冷冻离心机（Sigma公司产品）、倒置相差显微镜（OLYMPUS公司产品）、SG403A-HE生物安全柜（Baker公司产品）、CO2培养箱（Forma公司产品）、全自动高压灭菌锅（ALP产品）、电子分析天平（Sigma公司产品）、紫外-可见光光度计（Hach公司产品）。1.2 实验方法细

7、胞系培养：将骨肉瘤MG-63细胞系置于37、5%CO2培养箱内，以小牛血清（10%）、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素配置而成的RPM1640培养液贴壁培养。倒置荧光显微镜观察骨肉瘤MG-63细胞生长，胰蛋白酶（0.25%）消化传代，选择处于生长期的骨肉瘤细胞进行实验。1.2.2 观察骨肉瘤MG-63细胞形态取6孔培养板，每孔分别滴加骨肉瘤MG-63细胞悬浊液1mL，然后分别滴加100L浓度为1.25g/L、2.5g/L、5g/L、10g/L的木犀草素溶液以及等量磷酸盐缓冲液进行对照，于常规条件下进行培养。24h后使用倒置相差显微镜观察已培养好的肿瘤细胞样本，记录其形态特点，各浓度培

8、养的样本均重复观察3次，选择典型结果进行比较分析。1.2.3 划痕实验取6孔培养板铺满骨肉瘤MG-63细胞，观察细胞生长，于细胞贴壁长满时划痕，然后分别滴加100L浓度为5g/L、10g/L的木犀草素溶液以及等量磷酸盐缓冲液进行对照，于常规条件下进行培养，于0h与24h对划痕距离进行认真观察并拍照记录。1.2.4 侵袭实验5取已培养好的骨肉瘤MG-63细胞悬液，进行细胞计数，并将骨肉瘤MG-63细胞悬液的细胞数目调整为5×104个/100L后铺板。取24孔培养板，于每孔滴加RPM1640培养基，并在侵袭实验小室上室滴加调整好的骨肉瘤MG-63细胞悬液100L，以使每个上室内均含5&#

9、215;104个骨肉瘤MG-63细胞，然后于上室滴加1%牛血清白蛋白10L，以确保上室渗透压。分别滴加浓度为5g/L、10g/L的木犀草素100L，并于37、5%CO2培养箱内行15h常规培养。然后将小室取出以乙醇（90%）固定，结晶紫溶液（0.1%）染色，于×400低倍镜下观察观察拍照，选取4个视野做细胞计数，算出平均值。侵袭实验重复进行3次。1.2.5 免疫印迹实验6分别取木犀草素处理前及处理后的骨肉瘤MG-63细胞1mL，滴加细胞裂解液300L，行30min冰上裂解，然后哦移入1.5mL离心管中，4下通用台式冷冻离心机12000r/min速度离心5min，然后取出上清液并于-2

10、0下妥善保存。二喹啉甲酸法测定其蛋白浓度，每一个泳道40g上样蛋白量，将上样于80V下行30min聚丙烯酰胺凝胶电泳，于120V下行90min聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳完成后把蛋白移到PVDF膜上，以新配置成含脱脂奶粉（5%）的磷酸盐吐温缓冲液摇床行2h封闭，加入1:500的-Acrin抗体及1:500的IL-6抗体，于4反应18h后取出PVDF膜，使用磷酸盐吐温缓冲液洗涤3次，15min/次，取1:3000的辣根过氧化物酶标记二抗室温下封闭1h，以磷酸盐吐温缓冲液洗涤3次，10min/次，然后以化学发光法进行检测，并以X光片对结果进行记录。1.3 统计学方法以SPSS19.0统计学软件进行统计

11、分析，计量资料以±s表示，用t检验作组间比较，p0.05表示组间差异存在统计学意义。2 结果2.1 骨肉瘤细胞在形态上的变化在正常条件下培养的骨肉瘤MG-63细胞贴壁良好，形态规则，细胞透亮，轮廓清晰；经1.25g/L与2.5g/L木犀草素处理后的骨肉瘤MG-63细胞与正常条件下培养点细胞无显著差异，而经5g/L与10g/L木犀草素处理后的骨肉瘤MG-63细胞贴壁较弱或消失，且细胞皱缩，生长缓慢，部分破碎，多数悬浮分散生长。（如图1所示） 正常培养 5g/L木犀草素培养 10g/L木犀草素培养 图1 不同培养条件下骨肉瘤细胞形态图2.2 划痕实验结果培养0h时，三组骨肉瘤MG-63细

12、胞未见大量运动迁移，划痕区域覆盖率均为0%；经24h培养后，未使用木犀草素处理的骨肉瘤MG-63细胞可大量运动迁移，其划痕区域覆盖率为98.73%；使用 5g/L木犀草素培养的骨肉瘤MG-63细胞运动迁移能力有所降低，其划痕区域覆盖率为74.89%；使用10g/L木犀草素培养的骨肉瘤MG-63细胞运动迁移能力显著降低，其划痕区域覆盖率为52.86%。且未使用木犀草素处理、使用 5g/L、10g/L木犀草素培养覆盖率比较，存在显著统计学差异（p0.05）。2.3 侵袭实验结果和正常条件下生长的骨肉瘤MG-63细胞相比较，经过5g/L、10g/L木犀草素处理的骨肉瘤MG-63细胞，其穿膜细胞数量分

13、别降低至正常条件下生长细胞的60.03%、22.47%，正常条件下、使用 5g/L、10g/L木犀草素处理的穿膜细胞数量比较，存在显著统计学差异（p0.05）。2.4 免疫印迹实验结果和正常条件下生长的IL-6蛋白表达水平相比较，经过5g/L、10g/L木犀草素处理的骨肉瘤MG-63细胞，随着木犀草素浓度的增加IL-6蛋白表达水平逐渐降低，IL-6蛋白总量也逐渐减少。其具体结果如图2。 正常培养 5g/L木犀草素培养 10g/L木犀草素培养 图2 不同培养条件下IL-6蛋白表达水平图像和正常条件下生长的抗-Acrin抗体蛋白表达水平相比较，经过5g/L、10g/L木犀草素处理的骨肉瘤MG-63

14、细胞，随着木犀草素浓度的增加抗-Acrin抗体蛋白表达水平变化不显著，抗-Acrin抗体总量变化不显著。其具体结果如图3。 正常培养 5g/L木犀草素培养 10g/L木犀草素培养 图3 不同培养条件下-Acrin抗体水平图像3 讨论3.1 临床研究发现，骨肉瘤主要来源于间叶细胞，是由具有极强恶性增殖能力的肉瘤细胞产生的不成熟骨组织或者骨肿瘤性组织7。骨肿瘤可发生于任何年龄的人群，但多见于1525岁的青年人，男性多于女性，其发病率约为2:1。骨肉瘤主要侵犯干干骺区，甚至能够穿过骨骺对关节造成影响8。骨肉瘤恶性程度非常高，预后相当差，术后3年存活率只有不到20%，5年存活率只有不到5%。近几年来，

15、随着医疗水平的不断提高，骨肉瘤5年生存率逐渐提高，即便如此，仍然有40%左右的患者出现转移，并最终导致患者死亡9。相当多的研究表明，在骨肉瘤转移进程中，多数细胞因子的表达出现异常，如IL-6。作为一种效能较多的细胞因子，IL-6不但对肿瘤的生长与增值起着十分重要的作用，同时还可以促进生成肿瘤血管、肿瘤迁移、促使产生炎性反应。临床研究表明，异常高表达的IL-6及IL-6受体和肿瘤的发生有着密切的关系10。3.2 在本研究中，经5g/L与10g/L木犀草素处理后的骨肉瘤MG-63细胞生长恶劣，明显不如未经木犀草素处理及低浓度木犀草素处理的骨肉瘤细胞生长状况，提示较高浓度的木犀草素对于骨肉瘤细胞的生

16、长、增值具有一定的抑制效应。使用木犀草素处理的骨肉瘤MG-63细胞其运动迁移能力显著降低，划痕区域间隔明显，并且木樨草素浓度越高其划痕区域间隔就越明显，提示木犀草素能够显著抑制骨肉瘤MG-63细胞的运动迁移，并且其抑制能力与木犀草素的浓度呈明显的正相关关系。经过木犀草素处理的骨肉瘤MG-63细胞，其穿膜细胞数量显著降低，并且木犀草素浓度越高其穿膜细胞降低数量就越多，提示木犀草素能够显著抑制穿膜细胞的数量，并且其抑制能力与木犀草素的浓度呈明显的正相关关系。免疫印迹实验表明，骨肉瘤MG-63细胞IL-6蛋白表达水平随木犀草素浓度的增加而逐渐降低，提示木犀草素能够抑制IL-6蛋白的表达，并且其抑制能

17、力也与木犀草素的浓度呈明显的正相关关系。3.3 总之，本研究发现，木犀草素对于骨肉瘤MG-63细胞的生长、增值、运动迁移能力、穿膜细胞数量、IL-6蛋白表达水平均有一定的抑制作用，并且其抑制作用随着木犀草素浓度的增加而逐渐增加，说明一定浓度的木犀草素对于骨肉瘤MG-63细胞具有极强的抑制作用，值得应用于临床骨肉瘤的治疗。参考文献:1、徐统震, 孙雪飞,任冬梅,等.木犀草素抑制肺癌细胞A549的增殖及其联合化疗作用J山东大学学报(医学版)，2012，50（07）：50-54. 2、戴欢子.印迹基因TSSC3对骨肉瘤生物学特性的影响及其机制研究D.重庆：第三军医大学，2012年病理学与病理生理学博士学位论文.3、李烨.木犀草素、荭草苷和异荭草苷的UGT代谢机理及BCRP外排转运蛋白调控其代谢的机制研究D.广东广州：南方医科大学，2013年药剂学硕士学位论文.4、韩亚丽,缪竞诚,盛伟华，等.Ad-IL-24对MG-63人骨肉瘤细胞抑癌效应的体内外实验J生物工程学报，2009，10：1538-1545.5、姜英; 谢鲲鹏; 霍洪楠，等.木犀草素下调AEG-1和MMP-2的表达对血管生成和乳腺癌细胞侵袭性的抑制作用J生理学报，2013，65（05）：513-518.6、刘郁东.抑制mTOR通路在常氧及缺氧条件下对骨肉瘤细胞表型和生长相关分子的影响D湖北武汉：华中科技大学, 2013年