动植物基因组de novo常见问题

1、动植物基因组de novo常见问题基础知识1、什么是基因组de novo测序？答：对某一物种进行高通量测序，利用高性能计算平台和生物信息学方法，在不依赖于参考基因组的情况下进行组装，从而绘制该物种的全基因组序列图谱。 2、普通基因组的定义？答：单倍体，纯合二倍体或者杂合度<0.5%，且重复序列含量<50%，GC含量为35%到65%之间的二倍体。 3、复杂基因组的定义？答：杂合率0.5%，重复序列含量50%，GC含量处于异常的范围（GC含量35%或者GC含量65%的二倍体，多倍体。诺禾致源对二倍体复杂基因组进一步细分为微杂合基因组（0.5%杂合率0.8%、高杂合基因组（杂合率0.8%

2、）以及高重复基因组（重复序列比例>50%）。 4、怎么查询基因组的大小？答：查询植物基因组大小的网站：；查询动物基因组大小的网站：。 5、基因组的项目周期？6、基因组承诺的组装指标？答：简单基因组：contig N50>20K，scaffold N50>500K；复杂基因组：contig N50>20K，scaffold N50>300K。 样品要求1、动植物基因组测序对取样有什么要求？答：植物：需要黑暗无菌条件下培养的黄化苗、组培苗，基因组样本量500g1mg，越多越好。选择纯合或杂合度尽可能小的样品（杂合度<0.5%）。动物：应选取肌肉、血液等含脂肪较少

3、的部位取样，尽量选择同一个体取样，以减少个体差异性对后续拼接的影响。基因组样本量500g1mg，越多越好。样本的性别决定模式是XY型，则尽量选择雌性个体（XX型），如果是ZW型，则尽量选择雄性个体（ZZ型）。 2、全基因组测序对DNA样本有什么要求？答：（1）样品需求量（单次）：小片段文库，3g；2Kb5Kb大片段文库，20g；10Kb20Kb大片段文库，60g；完成全基因组测序样品DNA量需求约为500g1mg；        （2）样品浓度：对于小片段文库，50ng/l，对于2Kb5Kb大片段文库，150ng/l；对于1

4、0Kb20Kb大片段文库，150ng/l；        （3）样品纯度：OD260/280=1.82.0；无蛋白质、RNA污染或肉眼可见杂质污染；        （4）样品质量：基因组完整。如需建立5Kb的插入片段文库，则电泳结果，基因组DNA主带23Kb；脉冲场电泳结果，基因组DNA主带40Kb。 文库构建1、基因组测序的文库构建及测序策略？答：简单基因组：180bp、500bp、2K、5K、10K；PE100测序；测序深度一般为100-150X；&#

5、160;       复杂基因组：180bp、300bp、500bp、2K、5K、10K、20K；PE100测序；测序深度一般为200-300X。 2、DNA Fragment文库的定义、用途及实验流程？答：（1）定义：将基因组或大片段DNA随机打断成800bp的小片段（主要为200bp、300bp、500bp等），加上特定接头做成DNA文库后直接对DNA片段进行单末端（Single-End）或者双末端（Paired-End）测序，不需要克隆到细菌中，可以获得大量的DNA序列信息。    

6、60;   （2）用途：DNA Fragment文库制备的整个过程只需2天，单末端测序长度可达100bp，双末端为200bp。该技术测序通量高，可在全基因组水平上最大限度的、完整的获取基因组及多态性信息。广泛地应用于基因组的de novo测序、基因组重测序、BAC测序和长片段PCR产物测序等。        （3）实验流程： 3、DNA mate-pair文库的定义、用途及实验流程？答：（1）定义：首先将基因组DNA随机打断到特定大小（2-20kb）；然后经末端修复，生物素标记和环化等实验步骤后，再把环化

7、后的DNA分子打断成400-600bp的片段并通过带有链亲和霉素的磁珠将带有生物素标记的片段捕获。这些捕获的片段再经末端修饰和加上特定接头后建成大片段文库，不需要克隆到细菌中，直接在Illumina测序仪上进行测序。通过大片段文库构建，从而获得基因组中较大跨度（2-20kb）片段两端的序列。        （2）用途：DNA Mate-pair文库制备的整个过程需要5天，这种从较大跨度两端所获得的序列对基因组de novo项目的组装和基因组结构变异发掘具有非常重要的作用。    

8、60;   （3）实验流程： 信息分析1、什么是Read、Contig、Scaffold？答：Read：测序读到的碱基序列片段，测序的最小单位；Contig：由reads通过对overlap区域拼接组装成的没有gap的序列段；Scaffold：通过pair ends信息确定出的contig排列，中间有gap。 2、什么是N50，N70，N90？答：把组装出的contigs或scaffolds从大到小排列，当其累计长度刚刚超过全部组装序列总长度50%时，最后一个contig或scaffold的大小即为N50的大小，N50对评价基因测序的完整性有重要意义；N70和N90的计算方

9、法与N50类似，只是百分数变为70%或90%。 3、普通基因组的解决方案？答：诺禾采用自主升级的SOAPdenovoII进行普通基因组组装。        组装流程（图1）包括：       （1）构建不同长度的插入片段文库；       （2）构建de Brujin图；       （3）化简de Brujin图；  

10、0;    （4）构建contigs；       （5）构建scaffolds；       （6）补gaps；       诺禾致源的技术升级包括：       （1）开发了新的序列纠错模块，降低测序错误对组装的影响；       （2）在contigs组装步骤，开

11、发了Step K连接模块，以混合拼接算法连接contigs，从而提升原始的contigs长度；       （3）在scaffolds组装步骤，开发了ctg distance evaluation模块，更精确地评估contigs间的距离；同时开发了scaf construction模块，以新的连接单位来组装scaffold，从而提升scaffolds的连接准确率及长度。 图1  基因组de novo测序及拼接组装流程经过以上几步，最终简单基因组的组装结果至少应达到contig N50>20K，scaffold N50&

12、gt;300K。 4、复杂基因组（二倍体杂合）的解决方案？答：针对复杂基因组中二倍体杂合基因组，诺禾致源开发了NOVOheter软件，成功实现了二倍体杂合基因组组装。与SOAPdenovo相比，NOVOheter软件组装二倍体杂合基因组的技术创新主要体现在以下几个方面：（1）通过高深度测序（200-300X）将基因组上的杂合和纯合区域分开；（2）利用reads信息和PE关系连接杂合位点，延长原始contigs：在杂合部分间距离较短的情况下，利用reads信息将杂合位点连接起来，若杂合部分间距离较长时，利用Pair-End关系连接杂合位点（所以需要加入更多类型的小片段文库，以连接不同距离的杂合位

13、点），从而提高了contigs的长度，为后续组装打下基础（图3）； 图3 基于NOVOheter软件构建contigsa：利用深度信息区分杂合部分（覆盖度为n）和纯合部分（覆盖度为2n）；b：若杂合部分的距离较短（如60bp），则可利用reads信息将杂合位点连接起来；c：若杂合部分的距离较长（如400bp），则利用Pair-End关系，将杂合位点连接起来；d：得到杂合contigs。注：图中不同颜色的点表示杂合位点。（3）分区域构建scaffolds：同样利用contigs深度信息区分纯合contigs和杂合contigs；利用Pair-End关系将纯合contigs，杂合contigs分别

14、组装成scaffolds；最后将相邻的纯合contigs和杂合contigs进行连接，构建更长的scaffolds。 5、如何评价组装结果？答：常染色体区的覆盖度：评价基因组常染色体区的覆盖度，可以用BAC或者是Fosmid序列来评估；把已公布或者客户提供的BAC或fosmid克隆序列作为Refrence，将拼接完成的基因组序列map回已知的BAC或者fosmid序列上，检查拼接的序列对已知序列的覆盖度到什么水平。        基因区的覆盖度：评价基因区的覆盖度，可以用EST序列或者是转录组序列来评估；把已公布或者客户提供

15、的EST或转录组序列作为query序列map到拼接完成的基因组序列上，检查拼接序列对已知序列的覆盖度是达到什么水平。 6、影响基因组组装的因素？答：基因组的重复序列和杂合度，是否污染以及基因组的倍性情况。 7、基因组项目的标准生物信息分析的内容？答：基因组项目的标准生物信息分析的内容如下：（1）数据处理；（2）基因组组装：            基因组评估：基因组大小、GC含量、复杂序列、杂合度评；        &

16、#160;  组装：数据纠错；Contig、Scaffold组装；Gap填充；组装质量分析、评估和结果统计；（3）基因组注释：重复序列注释；基因预测；基因组功能注释；非编码RNA注释；（4）比较基因组学分析：            基因家族鉴定；           基因组共线性分析；           全基因组复制分析（动物：WGAC；