氨基酸的提取与精制

1、分离工程 期末论文氨基酸的提取与精制Extraction and Separation of Amino Acid学 院： 化学工程学院 专业班级： 化学工程与工艺 化工081 学生姓名： 於马骥 学 号： 050811139 指导教师： 戴卫东（副教授） 2011年6月期末论文中文摘要氨基酸的提取与精制摘 要：综合介绍了氨基酸提取过程中常用的分离技术以及近期的发展动态.如沉淀法、离子交换法、膜分离法和萃取法.并提出了氨基酸提纯精制的关键环节-结晶过程中应该注意的问题. 氨基酸是生物有机体的重要组成部分,是组成蛋白质的基本单元,具有极其重要的生理功能。提取和精制是氨基酸工业生产中的一个重要环节

2、,在其投资费用中占有很大比例 关键词：氨基酸; 沉淀法; 离子交换法; 膜分离; 反应萃取; 反向微胶团期末论文外文摘要××××Title××××Extraction and Separation of Amino AcidAbstract: The separation techniques of amino acids extraction,such as precipitating method,ion-exchange,membrane separation,liquid-liquid extraction

3、 are reviewed.And crystallization,which is the critical step in purification of amino acids,are introduced systematically to be put emphasis on. Amino acids are an important part of the biological organisms, is the basic unit of the component proteins, have very important physiological function. Ami

4、no acid extraction and refined is one of the important links in industrial production, in its investment very large proportion in chargeKeywords: amino acid;precipitation;ion-exchange;membrane separation;reactive extraction;reverse micelleation;1 引言或绪论R氨基酸是生物有机体的重要组成部分，是组成蛋白质的基本单元，具有极其重要的生理功能。提取和精制是

5、氨基酸工业生产中的一个重要环节，在其投资费用中占有很大比例 。研究提取与精制技术，对氨基酸工业的发展致关重要。发酵法得到的是单一品种的一氨基酸，夹杂其它氨基酸的种类和含量较少；蛋白质水解法得到的是多种氨基酸的混合物。目前，多数氨基酸采用发酵法生产，有的氨基酸则存在多种生产方法并存。氨基酸的发酵液经过预处理、离心或过滤出去菌体后，可对其进行初步的提取。主要的方法涉及沉淀、吸附、离子交换、萃取和电渗析过程。若想得到高纯度的氨基酸，还需进一步的精制提纯 超滤、结晶。氨基酸是一种具有两性官能团的物质。氨基酸含有一个a一氨基，一个a一羧基及一个侧链 ，通：式为RCH(NH：)COOH。当介质的pH达到一

6、定值时，氨基酸分子呈电中性，此时的pH称为氨基酸的等电点(pI)。当介质pH低于等电点，氨基酸以阳离子状态存在；当pH高于等电点，氨基酸以阴离子状态存在。氨基酸的溶解度随pH的变化很大，在等电点时，溶解度最小。1 沉淀剂分离法沉淀法分离氨基酸主要包括特殊试剂沉淀法、等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法。特殊沉淀法是最早应用于混合氨基酸分离的方法之一。某些氨基酸可以与一些有机化合物或无机化合物结合，形成结晶性衍生物沉淀，达到与其它氨基酸分离的目的。较为成熟的工艺有：精氨酸与苯甲醛在碱性和低温条件下，可缩合成溶解度很小的苯亚甲基精氨酸，将沉淀用盐酸水解除去苯甲醛，即可得精氨酸盐酸盐；亮氨酸与邻一二甲苯一4

7、一磺酸反应，生成亮氨酸的磺酸盐，后者与氨水反应，得到亮氨酸。组氨酸与氯化汞作用，生成组氨酸汞盐的沉淀，再经硫化氢的处理就可得组氨酸 。周锡梁等人 给出了从毛发角蛋白质经酸水解、碱中和、提取胱氨酸后的水解液中提取市场上缺乏的7种氨基酸的方法。分别以苯磺酸、苯甲醛、五氯酚、苯甲酸和苯三酸为沉淀剂分离亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸(其中，使用苯甲酸沉淀苯丙氨酸由于缬氨酸的影响，还需使用离子交换法进一步分离)。特殊沉淀法操作简单、选择性强。采用上述方法从提取胱氨酸后的废水中分离提取多种氨基酸，不仅可以大大降低排放液的含氮量，而且还有附加的经济效益。但是特殊沉淀法的沉淀剂回收较困难，排放废液中

8、参杂有沉淀剂，加重了污染，残留在氨基酸产品中的沉淀剂还会影响纯度。等电点沉淀法是根据氨基酸的等电点不同，在等电点处，氨基酸分子的净电荷为零，便于氨基酸彼此吸引形成结晶体沉淀下来。采用这种方法可以从生产半胱氨酸的废母液中回收胱氨酸 。半胱氨酸在水溶液中的溶解度比较大，而胱氨酸在等电点处溶解度很小。调整溶液的pH，再加入H 0，将半胱氨酸氧化成胱氨酸，就可以形成沉淀达到分离的目的。此外，目前国内味精厂也都采用等电点沉淀法提取谷氨酸。【1】2 离子交换法离子交换法是利用离子交换剂对不同氨基酸吸附能力的差异对氨基酸混合物进行分组或实现单一成分的分离。其在工业中有成功应用的实例，例如，味精厂采用强酸性阳

9、离子交换树脂对谷氨酸阳离子进行选择性吸附，以使发酵液中妨碍谷氨酸结晶的残糖及糖的聚合物、蛋白质、色素等非高子性杂质得以分离。日本味之素公司研究的氨基酸提纯技术采用逆流连续多级交换，可以大大减少树脂用量和洗涤树脂用水量 。GObor Simon等人 采用离子交换热参数泵从水解液和制革废水中浓缩分离氨基酸。利用热参数泵这一非稳态循环过程，根据流动相中氨基酸在不同温度下，在流动相和树脂上的分配系数不同这一原理，使氨基酸在离子交换柱的一端富集另一端减少，而达到混合氨基酸的分离。Soldatov等人 研究了液体磺酸基离子交换剂对脂肪族氨基酸阳离子的提取平衡。研究发现该离子交换剂对氨基酸提取的选择性要高于

10、苯乙烯磺酸树脂。Kisay Lee等人 发现芳香族氨基酸(苯丙氨酸和酪氨酸)在浓度较高时会发生非离子性吸附，吸附量偏离化学计量数较远，高于金属离子和脂肪族氨基酸，无法使用钠盐再生。25(质量分数)的乙醇溶液可以有效地抑制非离子性吸附。Tao Zuvi等人对氨基酸阳离子与氢离子的交换平衡进行了详细的研究，给出了10种氨基酸阳离子在低pH下的热力学平衡方程。离子交换树脂法提取氨基酸处理量大，工艺较成熟。但由于离子交换法分离混合氨基酸仅利用各氨基酸之间等电点的差异，只有当混合氨基酸之间的等电点相差较大时才能较好地分开，对于等电点相近的混合氨基酸只能部分分开或根本难以分离；氨基酸离子在树脂中的扩散速度

11、较慢，因此一方面要求料液的流速较低，另一方面对于氨基酸浓度较高的料液在上离子交换柱前还要进行稀释，这就必然导致所需的设备太大；并且，发酵液必须进行预处理，采用离心分离，或者添加高分子凝集剂使之沉淀，再用膜过滤等方法把微生物体除去：【2】3 膜分离法膜过滤法可以实现混合溶液的分离是因为在膜和溶液的界面处存在以下机理：由于亲水性等原因所引起的选择性透过；筛分效应一待分离物质分子的直径大于膜孔的直径，将被截留，反之则透过；电荷效应(Donnan效应)一若膜表面带与待分离物质同种电荷，则会产生静电排斥作用，反之则会产生吸引作用 。国外膜分离工艺已应用于乳制品工业：采用反渗透浓缩乳清，使用超滤法从乳清中

12、制备浓缩蛋白质，使用微米膜分离乳清中的蛋白质、去除脱脂乳中的细菌，使用纳滤膜去除乳清中的矿物质。近些年，又开始研究膜过滤分离蛋白质、肽和氨基酸的可行性。在人体的新陈代谢过程中存在大量生物膜渗透现象。研究氨基酸的膜分离不仅可以找出有效的生物分离技术，而且有助于加深对这些新陈代谢过程的理解。Timmer等人 选用了4种膜，对赖氨酸、亮氨酸和谷氨酸的膜过滤进行了考察。在pH=55时，赖氨酸带一单位的正电荷(pI =974)，亮氨酸不带电(pI舢=598)，而两者的分子体积相差不多。使用带负电荷的超滤膜，赖氨酸更容易透过，分离效果优于纳滤膜。在若氨基酸分子带净电荷，改变盐(如，NaC1，NaH，PO

13、)的浓度也可以改变超滤膜对氨基酸分子的截留率。在对混合氨基酸进行膜过滤时，其规律与对单个氨基酸进行操作是一致的。故调整氨基酸混合液的pH，改变其所带的电荷，并通过加入适当种类和浓度的盐可以提氨基酸的分离选择性。同时也证明了，当唐南效应占主导地位时，分离的选择性最高。电渗析也是对氨基酸发酵液脱盐浓缩的常用方法。MieMinagawa等人 。采用阳离子交换膜分离氨基酸，重点研究了pH对甘氨酸在界面传递的影响。采用理论模型对实验结果进行数学分析，结果表明氨基酸的传递过程的控制步骤是甘氨酸离开膜的过程。氨基酸的通量与浓度差不成线性关系，这说明氨基酸通过膜传递有一个饱和量。当接受相的pH较大时，甘氨酸的

14、传递速度较低。适当的改变pH能够提高甘氨酸通过阳离子交换膜的速率。对氨基酸发酵液进行超滤时，各种杂质会污染膜，降低过滤通量，甚至改变过滤的选择性。Doneva等人¨ 对氨基酸发酵液中的多种组分分别进行了实验，发现酵母精是导致膜污染的主要因素。作者还对酵母精超滤过程中氨基酸的动态吸附进行了研究，考察了氨基酸的浓度、所带电荷及膜的带电性对酵母精中氨基酸吸附和保留率的影响。实验发现，氨基酸的溶液的pH对吸附的影响较大，而氨基酸浓度的影响却并不明显。在大部分氨基酸的膜分离研究中，pH都是最重要的考察参数。因为氨基酸为两性物质，不同pH下的解离状态不同，所带的电荷数不同。此外溶液的pH还会影响

15、到膜上离子基因所带的电荷性质。若膜上的离子基团带负电荷，它能吸引和通过带正电荷的阳离子，而排斥带负电荷的阴离子；而带正电荷的膜则允许带负电荷的离子通过。在特定的分离要求下，选择适当类型的膜以及最佳的pH条件就成了决定分离效果好坏的关键。选择膜时应尽量同时使更多的分离机理起作用，提高分离的选择性。其它一些条件，如氨基酸溶液的浓度，盐的浓度也会对氨基酸的选择性透过有一定的影响。研究这些条件对分离效果的影响，可以优化膜分离过程，在对pH要求过于苛刻时，应该考虑改变其它条件(比如在过滤前稀释或浓缩氨基酸溶液，引入其它种类的盐或者是先脱盐再过滤)以减小操作成本，降低对环境的污染。【3】4 萃取法41 反

16、应萃取氨基酸不溶于普通有机溶剂，因此采用通常的溶剂萃取法不能奏效，必须采用反应萃取法，即选择适当的反应萃取剂，其解离出来的离子与氨基酸解离出来的离子发生反应，生成可以溶于有机相的萃取配合物，从而使氨基酸从水相进入有机相。迄今为止，人们采用了两类不同形式的反应萃取剂，一类是在低pH下萃取氨基酸阳离子，以酸性磷氧类萃取剂最为典型，如二(2一乙基己基)磷酸(D2EHPA)、十二烷基磷酸等。另一类是在高pH下萃取氨基酸阴离子的季铵盐，如甲基三辛基氯化铵(TOMAC)，是典型的阴离子萃取剂。Cascaval“ 采用D2EHPA通过改变水溶液的pH，完成了对一系列酸性、碱性和中性氨基酸的萃取分离，并认为可

17、以在工业生产中实现对氨基酸发酵液的萃取。近年来，采用溶剂萃取法分离氨基酸的研究报道很多，但大多是提出了专利申请，或处于研究阶段，未见工业报道。要实现工业化，至少要先解决两个问题：其一是萃取过程中乳化的问题。其二是低毒萃取剂的选择和萃取剂残留物对于产品质量的影响。萃取法用于处理发酵液，也取决于新方法在收率上与原来的方法相比较能够获得多大的经济效【4】益 。42 液膜萃取液膜萃取兼有溶剂萃取和膜渗透两项技术的特点按其结构可分为乳化液膜(emulsion liquidmembrane)和支撑液膜(supported liquid membrane)两大类。乳化液膜为液体表面活性剂形成的球面，将溶液分

18、为内相和外相，液膜只有几个分子厚，单位体积设备的表面积可达到1 000m2m 3 O00m m3¨ 。具有萃取速度快、分离与浓缩一步完成、能从低浓度的溶液中有效地回收溶质等优点。支撑液膜是将起分离作用的液相借助毛细作用同定在多孔高分子膜中，由载体、有机溶剂(或称稀释剂)和多孔高分子膜(或称支撑体)三个组分组成，其体系由料液、支撑液膜和反萃取液三个连续相组成，支撑液膜可以使萃取与反萃取在液膜的两侧同时进行，从而避免载体负荷的限制、减少了有机相的使用量，解决了乳化液膜的乳化液稳定条件及破乳等问题。将液膜法用于氨基酸的分离提纯已有20多年的历史。乳化液膜法存在的最大问题是液膜的稳定性。加入

19、稳定剂可以减小油水界面的表面张力，防止液膜破裂“ 。常用于氨基酸分离的表面活性物质有Paranox 100和CR一500。当然，还有大量的表面活性剂有待于研究开发。为了保证氨基酸能够顺利的透过有机液膜，选用适当的载体也是十分必要的。由于氨基酸分子在水溶液中携带电荷(等电点附近除外)，采用带净电荷的载体有助于氨基酸进入并透过厌水性的液膜。故季氨盐Aliquat 336和D2EHPA成为液膜法分离氨基酸最常选用的载体。而相比之下，D2EHPA又因为稳定性高、结合力强、在酸性水溶液中溶解度低、可用于萃取多种氨基酸并且价格较低等优势，更具有优势。除了在液膜中加入载体使之与氨基酸离子结合透过膜进入接受相

20、以外，还可以提前将氨基酸丹磺酚化，使之在一定的DH范围内维持电中性，以便于其穿过有机膜进入接受相 。通常的萃取效率为50 80 ，要高于支撑液膜。但支撑液膜因其结构简单的特点，可用于研究确定传递机理。【5】【6】43 反向微胶团萃取反向微胶团是在非极性溶剂中，双亲物质的亲水基相互靠拢，以亲油基朝向溶剂而形成的聚集体。用于形成反向微胶团的表面活性剂有两类：以琥珀酸二(2一乙基已基)酯磺酸钠(AOT)为代表的阴离子表面活性剂：以三辛基甲基氯化铵为代表的阳离子表面活性剂。以AOT表面活性剂所形成的反向微团含水量高，适合于蛋白质大分子的萃取。但是这两类反胶团萃取氨基酸时都要求氨基酸水溶液中的无机盐浓度

21、较低时才具有应用价值的萃取能力最早研究氨基酸在反向微胶团革取的Fendler等人提出氨基酸与反向微胶团的静电作用及其亲油性决定其在反向微胶团中的溶解度大小。随着研究的进一步深化，对于反胶团萃取氨基酸的萃取机理已经有了相当的认识：氨基酸是以带电离子状态被反向微胶团萃取的，不同带电状态下被萃取的程度不同；萃取后的氨基酸可能分布于两种环境下：反向微胶团的“水池”中和反向微胶团的表面活性剂单分子膜中 ” 。氨基酸分子的亲水性越强，其在“水池”中的分配比越高；pH对氨基酸的萃取的影响是通过影响氨基酸在水中的不同离子的浓度而影响氨基酸的总分配比的，离子强度的改变一方面改变反向微胶团的吸水率，另一方面影响同

22、离子的竞争萃取，从而影响氨基酸的总分配比；离子强度增大，反向微胶团对氨基酸的萃取能力下降，因此利用低离子强度下萃取高离子强度下反萃来实现对氨基酸的分离 。尽管反向微胶团萃取氨基酸的萃取机理有了明确的论断，并实现了利用反向微胶团对氨基酸的分离，但是反向微胶团萃取氨基酸刚刚起步，还有一些问题有待解决。由于反萃用的是离子强度更大的盐溶液，因此反萃液尚需进一步将氨基酸与无机盐分离，才能得到纯净的氨基酸。到目前为止大多数研究的只是适用于低盐浓度的氨基酸料液如发酵液，对于同时含有多种氨基酸且盐浓度高的料液如胱氨酸母液则不能适用。翁连进等人开发了一种新的、萃取能力更强的反胶团一二异辛基磷酸铵表面活性剂。这种

23、反胶团在盐浓度高达45molL的胱氨酸母液中仍具有令人满意大萃取率，并以此开发了从胱氨酸母液中提取精氨酸工艺【7】【8】5 结晶结晶是纯化物质的有效手段： 发酵液和提取液采用上述方法进行初步的分离提取之后，要得到具有一定粒度分布和晶体形状的成品还必须对其进行浓缩结晶和重结晶。这也是决定最终产品质量的关键。医药用输液氨基酸必须具有较高的纯度，这就要求结晶产品具有较大的粒度，以便于与母液分离；较小的晶体也易于形成聚结体，夹杂母液，降低产品的纯度。发酵法除了得到目标氨基酸外，还会产生与目标氨基酸结构相似的其它氨基酸：通常，在有机物的结晶过程中，若杂质分子与待结晶物质的分子结构相似，即使杂质浓度很低，

24、也会对晶体的成长和晶习产生很大影响。氨基酸分子由亲水的极性基和疏水的非极性基构成，这决定了氨基酸晶格的不对称性以及各晶面极性的差异性，进而导致结晶过程中不同晶面处固液界面性质(如界面张力、吸附性质、荷电性、润湿性等)的差异。这些因素会导致在不同溶剂、温度及杂质浓度条件下成核特性和不同晶面生长特性的复杂性和不确定性，这也是氨基酸结晶过程中产品晶型难以控制、甚至出现无定形的内在原因。为了得到具有特定粒度分布、主粒度和晶型的氨基酸晶体产品，必须对氨基酸结晶的整个过程进行良好的控制。多数氨基酸能溶于水，难溶于有机溶剂。其在水溶液中的溶解度和存在状态受pH的影响很大。相比之下， 一脯氨酸、 一精氨酸、

25、一精氨酸盐酸盐、 一赖氨酸盐酸盐、 一鸟氨酸盐酸盐在水中的溶解度较大；L一丙氨酸、 一苏氨酸、 一组氨酸的溶解度适中，且随温度变化不明显。 一胱氨酸和一色氨酸在水中的溶解度较小。Gupta 等人利用改进的UNIFAC模型预测了温度和pH对氨基酸在水中溶解度的影响。在缺乏实验数据的情况下可用于结晶分离过程的设计和优化。但通过实验测量仍是得到可靠数据的最有效方法。在已知溶解度的基础上选择适当的结晶方法，并使溶液过饱和度在整个结晶过程中维持在一个较低的水平。过高的过饱和度会使杂质分子嵌入到晶格降低产品纯度，而且会增加二次成核的几率。Tones和Mullin在考虑成核影响的基础上提出程序降温的系统方法

26、，可以有效地抑止二次成核。对于间歇冷却法生产氨基酸具有一定的指导意义。在工业结晶中，生物产品的多晶型现象必须给予足够的重视。因为许多情况下，只有特定的晶体形态才具有药理作用。Ostwald首先对多晶型现象给予了解释。认为非稳态系统不一定直接转变到稳定状态，而是先转变到与其最接近的状态。但使该理论有很多局限性。而对于多晶型现象最有可能的解释为，何种晶型最先出现是由稳定形态和较稳定形态晶体的相对成核和成长速率决定的，也就是说动力学因素起决定作用 。许多氨基酸存在多种晶型。单晶x光衍射表明， 一谷氨酸具有两种晶型，a一谷氨酸(亚稳态)为颗粒状，口一谷氨酸(稳态)为针形。何种晶型会优先出现与晶体析出的

27、温度有关。从工业结晶的角度看，a一型晶体更易与母液分离，更可取 母液中加入 一苯丙氨酸不仅有助于得到a一型晶体，还能抑制a一型晶体向一口型晶体转变。甘氨酸具有三种多晶型态(a，口和7)，a一甘氨酸晶体的空间群为P2 ，n； 一甘氨酸与a一甘氨酸的分子构形相同，但不稳定，在空气中很容易转变成a一形；7一甘氨酸晶体为六边形，空间群为P3 。a一氨基丁酸具有三种晶型(A，C和D)，在固态下可以相互转换、这种晶型的转换会使晶体产生缺陷，改变晶体密度有的还会形成双晶，所以应尽量避免 。 一组氨酸的两种形态A(正交晶系，空间群为P2。2。2。)和B(单斜晶系，空间群为P2)从溶液中析出的比例基本相同，而在

28、乙醇的存在下，B一型晶体会优先析出 。【9】【10】6 小结随着氨基酸发酵技术的发展，产酸率、糖转化率等指标都有了很大的提高。相比之下生物工程产品提取与精制的传统方法因其工艺过程复杂，费用通常高达生产成本的50 以上。所以，在这些方面的研究也也倍受重视。从相关报道的数量上来看，膜分离、液膜和反向微胶团萃取精制氨基酸研究的受关注程度更高。但是，在工业生产中大多采用的还是传统的分离技术。可见，新方法应用到实际生产中仍需进一步的完善。但新方法在操作、分离效率和能力等方面己经显现出相当的优势，相信一定会有良好的应用前景。参考文献：1 张伟国，钱 和氨基酸生产技术及其应用 M 北京：中国轻工业出版社，19972 周锡粱，杨 飚，蒙绮芳氨基酸系统分离提纯研究J深圳大学学报(理工版)，1994，l1(12)：79863 李燕，张关永从生产半胱氨酸的废母液中回收胱氨酸的工艺研究J氨基酸和生物资源，1998，20(2)：27 294 1TOH HISAOMeth