植物多酚槲皮苷的肠内吸收特征及其与肿瘤耐药机制P-gp相互

1、植物多酚槲皮苷的肠内吸收特征及其与肿瘤耐药机制P-gp相互作用研究李素云1，2 李峥2，李敬来2，张振清2 （1北京世纪坛医院，北京，100038；2军事医学科学院毒物药物研究所，北京，100850）摘要：目的 研究槲皮苷在Caco-2细胞内的摄取和代谢及植物多酚槲皮苷其在肠道吸收过程中与肿瘤耐药机制P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）间的相互作用及槲皮苷在Caco-2细胞内的摄取和代谢。方法建立槲皮苷及其代谢产物槲皮素和异鼠李亭浓度的LC-MS测定方法，利用Caco-2细胞研究槲皮苷的胞内摄取和代谢， 利用Caco-2细胞模型和LC-MS技术，通过测定槲皮苷、槲皮素和异鼠李亭

2、的浓度，研究槲皮苷在Caco-2细胞中的胞内摄取和代谢，以及孵育时间和P-gp抑制剂对槲皮苷胞内摄取和代谢的影响；采用流式细胞仪检测胞内钙黄绿素-AM浓度，探讨槲皮苷对P-gp的抑制作用。结果 15-120min各点均能在细胞内检测到槲皮苷，但未检测到槲皮素和异鼠李亭，胞内摄取呈现随时间递减的趋势（决定系数R 2=0.713，P0.001），在120 min内呈指数曲线下降。加入P-gp抑制剂后120min时槲皮苷的胞内摄取量提高1.3倍，有统计学意义（P=0.041）；胞内钙黄绿素-AM浓度在槲皮苷作用下显著增加（P0.05）。结论 槲皮苷即是P-gp底物，又是其抑制剂，在Caco-2细胞中

3、以完整的糖苷形式吸收，未发生观察到胞内转化或代谢。关键词：槲皮苷；LC/MS；Caco-2细胞；P-gp；代谢Study of The Intestinal Absorption of Quercitrin and interaction between quercitrin andWith P-gpLI Su-yun1，2 LI Zheng2，LI Jing-lai2，ZHANG Zhen-qing2 （1beijingshijitan hospital，beijing，100038；2Institute of pharmacology and toxicology，academy of m

4、ilitary medical sciences, beijing，100850）Abstract:Objective To investigate the intestinal absorption of quercitrin and the interaction between quercitrin andwith P-gp. Methods Caco-2 cell lines are used as models of human intestinal absorption and quercitrin，quercetin作者简介：李素云，女，河北省永年县人， 军事医学科学院2007级

5、在读博士研究生，主管技师，主要从事食物中非营养素食物成分营养作用研究，发表论文7篇。电话：（010）66235550，；手机E-mail：blueskyunl通讯作者：张振清，研究员，军事医学科学院毒物药物研究所。电话：（010）66930632，zhangzqamms6 quercitrin，quercetin and isorhamnetin in and out cell are determined by LC/MS to study cellular uptake and metabolism of quercitrin in Caco-2 cell ,an

6、d effects of incubation time and P-gp inhibition on its absorption and metabolism were evaluated as well. Cellular calcein accumulation was measured with Flow Cytometry to investigate the inhibition of quercitrin on P-gp. Result Quercitrin was found in Caco-2 cell from 15min to 120min ,but not querc

7、etin and isorhamnetin. Cellular quercitrin accumulation decreased with incubation time and exhibited a declining exponential curve at 120 min（R 2=0.713，P0.001）. Meanwhile, in the presence of P-gp inhibitor, the uptake of quercitrin by Caco-2 cells increased 1.3-fold (p < 0.05). And cellular calce

8、in accumulation significantly increased while quercitrin existed. Conclusion The results show that intact Quercitrin ,both substate and inhibitor of P-gp,was observed at 15 - 120 min and No significant converse and metabolism occurred hasnt been observed in the Caco-2 cells. Key words: quercitrin；LC

9、/MS；Caco-2 cell；P-gp；metabolism国内外大量研究显示，膳食中存在着大量的植物化合物，在人类健康中起着重要的作用，它们广泛存在于蔬菜、水果、茶叶、葡萄酒以及其它植物性食物中，同时也是许多中草药的有效成分，因此，近年来得到了广泛的关注1，成为营养学、药理学等多个领域的研究热点。-建议删除本段P-gp是最早发现的一种引起肿瘤多药耐药的转运蛋白，能介导细胞对多种药物耐药，在正常组织中广泛表达，其中在肾、肝、空肠、回肠、结肠等组织上高表达2，。 Caco-2细胞来源于人结肠癌上皮细胞，体外培养条件下，能分化形成致密的单分子细胞层，具有微绒毛结构，能表达多种蛋白载体和酶，具有类

10、似小肠上皮细胞且高表达P-gp的特性，近年来广泛用于药物和营养物质的摄取、外排及跨膜转运等肠道吸收和代谢机制的研究2，3。槲皮苷作为膳食和中药中重要的多酚类物质，槲皮柑作为槲皮素的糖苷衍生物，是广泛存在于人类植物性膳食和中草药中的重要的多酚类化合物之一，具有抗氧化、抗炎症、抗癌、清除自由基、保护心血管功能等诸多生物学作用。因此，阐明其对P-gp介导的多药耐药的作用以及与肠道P-gp间的相互对其肠道吸收的影响作用有着重要的意义。Caco-2细胞来源于人结肠癌上皮细胞，体外培养条件下，能分化形成致密的单分子细胞层，具有微绒毛结构，能表达多种蛋白载体和酶，具有类似小肠上皮细胞且高表达P-gp的特性，

11、近年来广泛用于药物和营养物质的摄取、外排及跨膜转运等肠道吸收和代谢机制的研究2，3。本文采用体外培养Caco-2细胞实验模型和槲皮苷标准品，研究槲皮苷在肠道转运特征及其与P-gp的相互作用以及这种作用对其肠道吸收特征的影响，以探讨在肿瘤治疗中营养、与疾病和药物的相互关系作用，为指导肿瘤的药物治疗临床用药和营养治疗提供理论依据。1 材料与方法1.1试剂 槲皮苷（quercetin-3-L-rhamnodiside，sigma公司）；环孢素A(Cyclosporin A，CysA，中国药品生物制品检定所)；色谱纯甲醇( Fisher公司)；DMEM 培养基(美国Gibico公司)；胎牛血清(Hyc

12、lone公司)；非必需氨基酸Hyclone公司)；L-谷氨酰胺(Sigma公司)； 胰蛋白酶(Sigma公司)；钙黄绿素-AM (Calcein-AM，Sigma公司)；超纯水(MilliPore公司)，其他试剂均为分析纯。1.2 主要仪器 细胞培养箱(SANYO，Japan)；倒置电子显微镜(Olympus，日本)；Agilent 1100 LC/MSD SL型液相色谱/质谱联用仪 (Agilent，美国)；24孔培养板(Costar, 美国)；Milli-Q Gradient A10 超纯水器(Millipore Inc. 美国)；流式细胞仪(BD，美国)。1.3细胞培养条件和方法(请简明

13、扼要介绍方法。如有引用，请注明出处)Caco-2细胞株（购自ATCC），传代数在40-50代之间。将先将细胞接种于细胞培养瓶，（培养基为 培养液为DMEM高糖培养基，, 培养基中（含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺以及青霉素-链霉素双抗液），置于37、5%CO2培养箱中培养。，隔天更换培养基。生长34天细胞融合后，用0.25 %胰蛋白酶-EDTA（0.2 %）混合消化液，于37 条件下消化，制备细胞悬液，细胞按6×104个/cm2接种于24孔培养板，隔天换培养液，1周后开始进行胞内摄取实验2，3。1.4 胞内摄取实验4 除去细胞表面附着物（如何做？），将接种有细胞

14、的24孔培养板用PBS清洗3次，弃上清，每孔加入含相应浓度槲皮苷的PBS液200L (pH=7.2)。置37、5%CO2培养箱孵育。分别于15、30、45、60、90、120min取样。取出的细胞孵育液（细胞外液），精密加入含内标的甲醇溶液，使内标终浓度为10g·L-1，震荡混匀，高速离心后取上清200L，以20 L进样测定槲皮苷、槲皮素和异鼠李亭浓度。细胞用PBS轻轻清洗三次，各孔加超纯水200L,-80反复冻融3次，破碎细胞，精密加入含内标的甲醇溶液,同样使内标终浓度为10g·L-1，震荡2min, 高速离心后取上清150L，同上测定。P-gp阳性特异性抑制剂组，先加入

15、抑制剂（CysA（ 2×104 mg·L-1 pH=7.2) 100L，作用15min后，再加入等量含18×103mg·L-1槲皮苷的PBS液，120min后取样，其余实验步骤与前述相同。用改良Lowry法检测细胞蛋白含量，以此矫正测得的胞内槲皮苷、槲皮素和异鼠李亭浓度，胞内浓度用g·L-1 protein 表示。1.5槲皮苷对Caco-2细胞摄取钙黄绿素-AM的影响5试验分5个组，分别为试验组（高浓度、中浓度、低浓度组）和P-gp抑制剂阳性对照组、阴性对照组，每组设3个平行样品（n=3）。制备Caco-2细胞悬液，用37 的PBS溶液清洗细胞

16、3次，调整细胞密度为1×106·mL-1。取300L细胞悬液，试验组加入100L含相应浓度槲皮苷的PBS液，P-gp抑制剂阳性对照组加入相应浓度的P-gp阳性抑制剂CysA5，阴性对照组加PBS溶液，作用15 min后各加入100L的钙黄绿素-AM（1m g·L-1），孵育45 min后，流式细胞仪检测各组细胞中的荧光强度。1.6 LC/MS分析色谱柱：Agilent-C18柱（2.1mm×50 mm，3.5m）；柱温为室温，流动相为含0.1% 甲酸的甲醇：水（35：65），流速0.2mL/min，进样20L。质谱检测部分用电喷雾离子源，雾化气压力为30

17、 psi，干燥气流速为8L/min，干燥气温度为35 ，毛细管压力3000V，四极杆温度保持在99 ，增益为1，峰宽为0.10min，选择正离子模式，采用选择离子监测（SIM）以提高样品测定的灵敏度。 m/z槲皮苷为449，槲皮素为303，异鼠李亭（3-O-甲基槲皮素）为317，内标（丁螺环酮）为386.2。1.8 统计学分析 数据用x±s表示，用SPSS13.0对数据进行统计分析，统计方法采用两样本均数比较t检验和单因素方差分析进行统计处理（采用什么软件？）。2 结果2.1 LC/MS方法学考察LC-MS对槲皮苷、槲皮素和异鼠李亭保留时间tR分别为2.50、5.90、7.89 mi

18、n，且在目标峰保留时间溶液中无杂质峰干扰样品的测定。槲皮素在52000ug·L-1浓度范围内线性关系良好，槲皮苷和异鼠李亭在12000ug·L-1浓度范围内线性关系良好，三者在10, 100和1000 ug·L-1三种浓度水平下，日内及日间精密度均在±15%内，符合本试验的测定要求。2.2槲皮苷在不同时间的胞内摄取槲皮苷在9×103mg·L-1浓度条件下不同时间的胞内摄取结果见图1。在9×103mg·L-1浓度下，不同时间点均能在细胞内检测到槲皮苷，说明槲皮苷可以以完整的分子形式直接被吸收。但胞内摄取量呈现一个随时

19、间递减的现象，经指数回归分析，决定系数R 2=0.713，P0.001，在120 min内呈指数曲线下降，说明槲皮苷在Caco-2细胞内可能尚存在其他的转化或外排机制。40.000030. 000020.000010.0000120100806040200时间（min）ExponentialObserved胞内摄取量（(mg·L-protein）15min时点； 30min时点； 45min时点； 60min时点； 90min时点； 120min时点经指数回归分析，决定系数R2=0.713，P<0.001经指数回归分析，决定系数R 2=0.713，P0.001。不同时间槲皮苷（

20、9×103mg·L-1）的胞内摄取呈指数曲线变化，并且随着时间的增加而下降。图1 槲皮苷在不同时间的胞内摄取(mg·L-1protein) 趋势散点图2.3 120min时点P-gp对槲皮苷摄取的影响120min时点P-gp对槲皮苷胞内摄取的影响见图2。实验组只加槲皮苷，阳性对照P-gp阳性抑制剂组加入槲皮苷和P-gp阳性抑制剂cysA（2×104mg·L-1），以抑制P-gp的外排作用。实验结果表明，阳性对照组由于P-gp的外排作用受到抑制，造成槲皮苷的组较不加阳性抑制剂组的胞内摄取显著增高，经两样本均数比较的t检验，t=2.965，P=0.

21、041，差别有统计学意义，说明槲皮苷是P-gp的底物（本结论的依据不足），在Caco-2细胞内存在P-gp对槲皮苷的外排作用，P-gp介导的肿瘤多药耐药机制会抑制对槲皮苷在肠道的吸收产生阳性抑制作用。 1、2、3 为：各处理组的3个平行样品，“average”4为：3个相应平行样品平均值；P=0.041；结果表明，阳性抑制剂组的胞内摄取显著增高，经两样本均数比较的t检验，t=2.965，P=0.041图2 120min时cysA（2×104mg·L-1)P-gp对槲皮苷胞内摄取的影响 2.4槲皮苷在CACOCaco-2细胞内的转化和代谢6，7槲皮苷在9×103mg

22、·L-1浓度下的不同时间点，细胞内和细胞外液均未检测到槲皮苷的脱糖基产物槲皮素及其进一步的代谢产物异鼠李亭，说明在现有检测条件下未观察到槲皮苷在细胞内的不发生转化和代谢。2.5 槲皮苷对钙黄绿素-AM细胞摄取的影响钙黄绿素-AM是P-gp的底物4，5（文献依据？），进入细胞后会在胞内酯酶的水解下转化为荧光性的化合物钙黄绿素，通过对其胞内含量的检测（用荧光强度来表示），评价化合物是否具有对P-gp的抑制功能。槲皮苷在不同浓度下，胞内钙黄绿素的浓度见图3。与阴性对照组（PBS）组相比，槲皮苷组和P-gp阳性抑制剂CysA组在3个不同浓度下，均可抑制P-gp底物钙黄绿素-AM外排，导致钙黄

23、绿素的胞内浓度显著增加。经单因素方差分析，F=26.021，P0.001，进一步Dunnett-t检验（单侧），各组与PBS对照组比较，P值分别为0.010、0.001、0.001、0.023、0.002、0.005，差别均有统计学意义，可以认为槲皮苷对P-gp的外排功能有抑制作用（抑制什么？抑制功能？而且本结论的证据不足）。7654321处 理 组2200.002000.001800.001600.001400.00荧 光 强 度1：阴性 PBS对照组（PBS）；2：P-gp阳性抑制剂cysA 5×103mg·L-1对照组；3：P-gp阳性抑制剂cysA25×1

24、03mg·L-1对照组；4：P-gp阳性抑制剂 cysA 5×103mg·L-1组；3 cysA25×103mg·L-1组；4 cysA50×103mg·L-1对照组组；5：槲皮苷3×103mg·L-1试验组：槲皮苷9×103mg·L-17试验组： 槲皮苷3×103mg·L-1组； 6 槲皮苷9×103mg·L-1组；7 槲皮苷27×103mg·L-1试验组组；经单因素方差分析，F=26.021，P0.001，进一步Dunne

25、tt-t检验（单侧），各组与PBS对照比较，P值分别为0.010、0.001、0.001、0.023、0.002、0.005，差别均有统计学意义，可以认为槲皮苷对P-gp有抑制作用；各组与PBS对照比较，P <0.05 图3不同浓度槲皮苷和P-gp阳性抑制剂对钙黄绿素-AM的胞内摄取-图注可参照第三军医大学学报相关文章进行修改。箱式图3 讨论槲皮柑作为槲皮素的糖苷衍生物，是广泛存在于人类植物性膳食和中草药中重要的多酚类化合物之一，具有抗氧化、抗炎症、抗癌、清除自由基、保护心血管功能等诸多生物学作用。而槲皮素糖苷衍生物在肠道中的吸收与其所结合的糖基密切相关8，9。关于槲皮素糖苷衍生物的吸收

26、机制有两个，一是槲皮素糖苷衍生物由位于肠细胞上的乳糖根皮苷酶水解释放出槲皮素,然后被吸收；二是通过钠-葡萄糖转运体主动转运进入细胞，被存在于胞质内的糖苷酶水解释出苷元。Wieslaw Wiczkowski等的实验结果表明，前一吸收机制在槲皮素葡萄糖苷吸收中起主要作用8。但是，对槲皮素鼠李糖苷（槲皮苷）的吸收情形尚没有更深入的研究和报道。Wieslaw Wiczkowski等的实验表明，分别给四组在给小鼠喂饲含等量槲皮素的槲皮素苷元、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-鼠李糖苷（槲皮苷）和芸香苷,四小时后,小鼠血浆中几乎检测不到的槲皮素苷元和槲皮素代谢产物开始出现于血浆中，其中槲皮素-3-葡萄糖苷

27、组是槲皮素苷元的3倍，芸香苷膳食组很低，槲皮素-3-鼠李糖苷几乎检测不到，因此认为鼠李糖苷在小肠不被吸收3。而Xiao-Juan Tian等则在CACOCaco-2细胞单层模型上观察到了槲皮苷AB和BA的双向转运（何谓双向转运？）6，但对槲皮苷以什么形式进入细胞和在胞内是否发生了转化或代谢，该文未予研究。本实验利用贴壁生长的Caco-2，通过切断槲皮苷的基底侧出胞途径(如何做到?)，观察槲皮苷在Caco-2的胞内摄取，发现槲皮苷以完整的糖苷形式进入细胞，并在细胞抽提液（内液）和细胞孵育液（外液）中都均未检测到槲皮苷的脱糖苷产物槲皮素苷元以及槲皮素的甲基化代谢产物异鼠李亭10 ，说明槲皮苷可以被

28、肠道吸收模型Caco-2细胞完整地吸收，在现有检测条件下肠道吸收模型CACO-2细胞中槲皮苷没有观察到槲皮苷发生的胞内转化和代谢。-本文与Xiao-Juan Tian相同，也采用Caco-2细胞，但结果却不一样，请分析原因？但是否存在乳糖根皮苷酶水解途径，由于CACO-2细胞上该酶的表达较低下，因此，尚需进一步的实验和研究。同时本实验还观察到，槲皮苷的胞内摄取呈现一个随时间呈指数曲线下降的趋势。进一步的实验证实，在CACOCaco-2细胞内存在P-pg对槲皮苷的外排作用，这也许可以解释或部分解释槲皮苷胞内摄取呈指数曲线下降的趋势特征，同时说明由P-gp介导的肿瘤多药耐药，在将药物泵出的同时，也

29、会机制也会将进入胞内的槲皮苷泵出到肠腔，从而影响槲皮苷的肠道吸收（本句不通，不能说“. 机制影响.的吸收”）。但是，这一外排作用具有一个什么样的时间依赖性，以及是否还存在其他的机制参与槲皮苷的外排或转化，仍有待深入研究和探讨。 另外， 槲皮苷对钙黄绿素-AM细胞摄取的实验影响实验表明，槲皮苷是P-gp的抑制剂，三个实验组(3、9、27×103mg·L-1)与阳性抑制剂对照组比较对P-gp外排功能均表现出显著的抑制作用（p值分别为0.023、0.002、0.005和0.010、0.001、0.001），说明槲皮苷同时也具有一定的改善肿瘤耐药的作用。-抑制什么？。但是，该实验所

30、取得的结果仍有许多缺陷和不足，在槲皮苷的肠道吸收过程中是否存在乳糖根皮苷酶水解途径、P-pg对槲皮苷的外排作用具有一个什么样的时间依赖性、是否还存在其他的机制参与槲皮苷的外排或转化、以及槲皮苷是通过竞争性结合还是其他机制抑制P-gp的外排作用等，仍有待完善实验条件和实验设计后进行进一步深入的研究和探讨。 总之， 槲皮苷与P-gp在肠道吸收模型Caco-2细胞中的相互作用，为深入进一步阐明槲皮苷对P-gp介导的肿瘤多药耐药的改善作用以及P-gp介导的肿瘤多药耐药对槲皮苷肠道吸收的抑制作用奠定了一个细胞水平营养、药物和疾病之间的关系奠定了一个初步的实验基础，为进一步开展研究疾病营养营养与药物在肿瘤

31、治疗中的作用和意义和指导用药开创了一个新思路。-结论较泛。应就本文所得结果、结果之间相互联系及其意义进行分析得出结论。参考文献1Scalbert A.,Johnson I.T., Saltmarsh M. Polyphenols: antioxidants and beyond.Am J Clin Nutr,2005,81(suppl):215s.2Djuv A,Nilsen OG.Caco-2 cell methodology and inhibition of the P-glycoprotein transport of digoxin by Aloe vera juice J.Phyt

32、other Res,2008,22(12):1623-1628.3Yang XW,Yang XD,Wang Y,et al.Establishment of Caco-2 cell monolayer model and standard operation procedure for assessing intestinal absorption of chemical components of traditional Chinese medicine J.Yi Jie He Xue Bao.2007;5(6):634-641.4von Richter O,Glavinas H, Krajcsi P,et al. A novel screening strategy to identify ABCB1 substrates and inhibitors J.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,2009,379(1):11-26.5Tan W,Chen H,Zhao J,et al. A study of intestinal absorption of bicyclo