泛素结合酶UFC1基因的原核表达载体构建

1、泛素结合酶UFC1基因的原核表达载体构建周后兵，黄文雄，颜斌，阳晨希，刘姝梅，吴娟，贺爱兰*【基金项目】湖南省自然科学基金（09JJ6048）、湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目 (2011)、湖南省教育厅科学研究项目 (11B066)【作者简介】周后兵（1989-），男，湖南株洲人，2008级生物技术专业本科学生 。【通讯作者】贺爱兰（1975），女，硕士， E-mail: pdheailan。 湖南人文科技学院，中国湖南 娄底 417000摘 要 克隆人的泛素结合酶UFC1 (ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1)基因，并为实现U

2、FC1基因的原核表达、纯化及多克隆抗体制备做准备。方法：采用RT-PCR方法从宫颈癌Hela细胞中扩增UFC1基因全长cDNA，双酶切后克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中，构建并鉴定pGEX-4T-2-UFC1质粒。结果：双酶切鉴定和测序分析均证实，已成功构建pGEX-4T-2-UFC1重组载体。结论：成功构建泛素结合酶UFC1基因的原核表达载体，为在原核系统中表达UFC1重组蛋白，并制备多克隆抗体奠定了基础，也为进一步研究UFC1基因功能提供了工具。 关键词 UFC1基因；克隆；原核表达载体 中图分类号 Q78 文献标识码 A􀀂 泛素化修饰涉及泛素激活酶E1、泛素结合酶

3、E2和泛素连接酶E3的一系列反应。Ufm1（ubiquitin-fold modifier 1)是一种类泛素修饰因子，泛素结合酶UFC1（ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1）在Ufm1泛素系统中，是一个类似泛素结合酶E2功能的基因。Ufm1因子通过 Uba5 (E1) 和 Ufc1(E2)共价结合到靶蛋白上1-3。目前，泛素和类泛素调节的蛋白质降解过程在生物体中的作用非常重要，因而对它的开创性研究也就具有了特殊意义。目前，在世界各地的很多实验室中，科学家不断发现和研究与这一降解过程相关的细胞新功能。这些研究对进一步揭示生物的奥秘，以及探索一

4、些疾病的发生机理和治疗手段具有重要意义。1 材料与方法1. 1 材料原核表达质粒pGEX-4T-2、大肠杆菌BL21（DE3）、人宫颈癌Hela细胞株由本实验室保存。新西兰兔体重( 23 kg) 购自中南大学湘雅医学院附属第二医院动物中心。限制性内切酶EcoR和Not、T4-DNA 连接酶等购自New England Biolabs 公司；Taq聚合酶、DNA marker及琼脂糖等购自TaKaRa 公司； PCR引物合成及测序由上海Sangon公司完成； 凝胶回收试剂盒以及质粒提取试剂盒购自杭州新捷生物科技有限公司； RNA反转录试剂盒为promega公司产品；DMEM高糖培养基购自Gibc

5、o公司；新生小牛血清为杭州四季青公司产品；其它常规试剂均为国产分析纯。1. 2 RT-PCR扩增UFC1的cDNA序列根据GenBank ( NM _016406 ) 中人UFC1基因的mRNA序列，以及pGEX-4T-2载体上的酶切位点，设计并合成一对引物：PUF（上游引物）和PUR（下游引物）, 引物的5端分别加上EcoR、Not限制性酶内切位点。PUF: 5-CCG GAATTC CCATGGCGGATGAAGCCACGCGA -3 (下划线为EcoR酶切位点)PUR: 5- ATAAGAAT GCGGCCGC TCATTGGTTGCATTTCTC -3(下划线为Not酶切位点)当Hel

6、a细胞长至90%，收集细胞，用PBS洗一次，800 rpm离心5 min，去上清； 根据Trizol方法, 提取总RNA。取5 g总RNA，构成20 l反应体系，按Promega的反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。得到cDNA后，以反转录产物2 l为模板， 以PUF、PUR为引物进行常规PCR扩增, 总反应体积30 l，扩增条件为：94预变性4 min，94变性1 min，60退火30S，72延伸40S，30个循环，72延伸10 min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳观察后, 用凝胶回收试剂盒回收约500bp的DNA条带。1.3 pGEX-4T-2-UFC1重组表达载体的构建用EcoR和

7、Not双酶切pGEX-4T-2载体，胶回收线性化的载体；同时也用这两种酶对UFC1 扩增片段双酶切、并用PCR 产物纯化试剂进行纯化回收。再用T4-DNA 连接酶将回收的pGEX-4T-2线性载体和带有相同酶切位点的UFC1扩增片段于16连接过夜, 而后转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中，经过PCR法筛选，用质粒提取试剂盒提取质粒, 并对质粒进行EcoR和Not双酶切及测序鉴定, 构建带有UFC1 的pGEX-4T-2真核表达载体, 命名为pGEX-4T-2-UFC1载体。2 结果2.1 获得UFC1基因的cDNA序列 以Hela细胞的RNA为模版进行RT-PCR实验，合成cDNA，再以cDN

8、A为模板进行PCR扩增，获得UFC1基因的cDNA序列。PCR产物约500 bp，与GenBank中人UFC1基因的CDS序列大小( 504 bp)相符2.2 筛选阳性克隆 用PCR法筛选阳性克隆，经电泳分析发现，在筛选的 5 个菌落中，有3个菌落可见到 约500 bp 大小的阳性条带, 与预期片断大小一致，因此，推测这3 个克隆即为含有UFC1 基因的阳性克隆。2.3 表达载体的双酶切鉴定及测序鉴定选取阳性克隆提取质粒DNA , 并进行EcoR和Not双酶切鉴定，结果显示为约500bp的条带和约5 kb的载体片断, 其结果符合所构建质粒特征。经 PCR 及双酶切鉴定的pGEX-4T-2-UF

9、C1重组体的质粒送上海生物工程技术服务公司测序，测序结果表明, 所克隆的UFC1 序列与GenBank所报道的序列完全一致。3 讨论在前期研究中，利用芯片技术筛选出了一批在乳腺癌与正常组织中有差异表达的基因，其中有一个基因就是UFC1。在一系列乳腺细胞系和组织中做了UFC1基因的表达谱分析，发现乳腺癌组织中UFC1基因的表达明显高于正常乳腺组织，乳腺细胞系的表达谱分析也是如此，其表达量的不同，提示UFC1基因与乳腺癌的发生和发展有着密切关系4,5。最近还发现了在考力代羊的皮肤黑斑中，UFC1基因的表达也异常6，所以研究泛素结合酶UFC1在乳腺癌中的作用有着重要的意义。本试验正是从这一点出发从宫

10、颈癌Hela细胞中克隆UFC1基因全长序列， 并且构建了原核表达载体pGEX-4T-2-UFC1，为实现UFC1基因的原核表达、纯化及多克隆抗体制备奠定了基础，也为进一步研究UFC1基因功能提供了工具。参考文献1. Komatsu M, Chiba T, Tatsumi K, Iemura S, Tanida I, Okazaki N, Ueno T, Kominami E, Natsume T, Tanaka K: A novel protein-conjugating system for Ufm1, a ubiquitin-fold modifierJ.Embo J 2004, 23(9

11、):1977-1986.2. Liu G, Aramini J, Atreya HS, Eletsky A, Xiao R, Acton T, Ma L, Montelione GT, Szyperski T: GFT NMR based resonance assignment for the 21 kDa human protein UFC1J.J Biomol NMR 2005, 32(3):261.3. Mizushima T, Tatsumi K, Ozaki Y, Kawakami T, Suzuki A, Ogasahara K, Komatsu M, Kominami E, T

12、anaka K, Yamane T: Crystal structure of Ufc1, the Ufm1-conjugating enzymeJ.Biochem Biophys Res Commun 2007, 362(4):1079-1084.4.贺爱兰, 吴小玲, 张波. UFC1基因在乳腺癌细胞中的表达及意义J.长沙大学学报, 2011,25（2）:75-77(2011/03).5. 贺爱兰, 张 波, 刘如石. UFCI基因在乳腺癌和正常乳腺组织中的表达J. 湖南师范大学自然科学学报, 2011, 3:69-72(2011/06).6. Peñagaricano F, Zorrilla P, Naya H,