香菇多糖地提取纯化方法

1、香菇多糖的提取纯化方法吕红常秀莲*某某大学生命科学院，某某264005摘要：香菇多糖是香菇中别离出的一种重要的具有生理活性的物质，具有抗病毒、抗肿瘤、 增强人体免疫力等多种功能，在保健食品和药品开发方面具有广阔的应用前景。概括介绍当前常用的热水浸提法、酶解法、微波提取法和深层发酵培养法等6种香菇多糖的提取方法。并简单比拟香菇多糖提取的这几种方法并介绍了超滤-渗滤法和活性炭联合陶瓷膜超滤法这两种香菇多糖的纯化方法。关键词：香菇多糖；提取；纯化；抗癌;抗病毒Extract on and purificati on of LentinanLvh ong cha ngxiulia n*(Ya ntai

2、 uni versity life academy of scie nces, Yan tai 26005)Abstract: Lentinan was isolated from mushrooms with an importa nt physiological activity of substances with anti-virus, anti-cancer, enhance immunity and other functions. It has broad application prospect s in health food and drug' s deveopoe

3、nview of the currentformulati on used in hot water, en zymatic method, microwave extract ion and deep ferme ntati on method 6 kinds of mushroom polysaccharides method, And In troduced theUltrafiltratio n-filtratio n method and the Activated carb on ceramic membra ne joi nt ultrafiltration method of

4、Lentinan purification.Keywords: Mushroom polysaccharide ;Separation ; cancer ;antiviral1引言香菇多糖(Lentinan)是一种3-1,3-葡聚糖,是从担子菌纲伞菌科真菌香菇子实体中提取别 离纯化获得的均一组分的多糖，能治疗癌症，抗恶性肿瘤，抗病毒，抗感染，提高人体免疫力等多种生理功能。目前国内对香菇多糖的别离有了很大开展，主要采用的方法有传统热水提取法、酸提取法、碱提取法、这些方法都有其优点，也有其难以克制的不足之处。与传统方 法相比微波辅助提取法具有设备简单，快速，高效，安全等特点。2香菇多糖的提取方法2

5、.1热水浸提法这是最早采用的一种传统方法：香菇多糖溶于水，热水浸提时，香菇组织细胞膨胀破裂，多糖成分浸出。热水浸提香菇多糖，浸提时的料液比、温度、时间、pH、醇析时的乙醇添加倍数与提取次数是影响多糖得率的主要因素。对料液比而言，假如加水太少，提取不彻底；加水太多，容易降低提取液的固形物含量， 不利于以后的别离，且加重了工业生产中的后续工艺，一般为1 : 20左右。对温度来说，随着提取温度的升高，粗多糖得率逐渐升高，在80% 一 95%时达到顶峰，再提高温度时，粗多糖得率升高趋势趋于平缓，考虑到高温会破坏多糖的结构，影响其生物活性，同时高温提取对工业化生产的设备要求更严格。所以，提取温度一般以8

6、0C 95C为宜。随着提取时间的延长，粗多糖得率逐渐增加，0.5h 一 3h之间趋势明显，继续延长提取时间，多糖得率加趋势逐渐趋于平缓，一般浸提时间为8h一 12h。热水浸提时的pH为自然pH值，大约在6-8之间。而对醇析时提取液的乙醇浓度来说，随着其逐渐升高，多糖得率亦逐 渐增加，但乙醇浓度达到 75%后再继续添加乙醇，对粗多糖得率的影响不大，所以提取液的 乙醇浓度最好不超过75% 。当然，提取次数对多糖得率也有一定的影响，多糖得率随着提取次数的增加而增加，但提取次数超过2次后，多糖得率增加缓慢， 趋于平缓。我们通常可以确定2次提取为比拟适宜 的提取次数1。总的来说，热水浸提法的最优提取条件

7、由具体的实验环境而定，一般可根据正交实验确定。应注意几点： 浸提过程必须充分，这是前提。浸提后过滤时应尽量趁热过滤，否如此温度降低，物质问的黏度增大，过滤时间增长。（3）浓缩过程受仪器影响较大。一般旋转蒸发仪是一种较好的浓缩装置。2. 2稀酸（碱）浸提法从香菇中提取多糖的提取剂有：酸液、碱液、酶与热水等，提取剂为酸（碱）时，即所谓的酸（碱）提取法。该法提取香菇多糖也受多方面因素的影响：酸（碱）溶液的浓度、作用时间等。一般情况下，0.4mol/L的HC1溶液在40 C 60CX围内，多糖得率较高2。需注意， 香菇多糖的提取应防止在强酸、强碱溶液中进展，否如此极易造成香菇多糖中糖苷键断裂与构象变化

8、而形成较多单糖，影响多糖得率，因此香菇多糖较少采用此法提取。2.3酶解法香菇细胞壁主要由纤维素、果胶等组成，细胞膜主要由蛋白质和磷脂组成，因此我们可以用具有专一性和高效性的酶，如纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等来提取香菇多糖。近年来有报道用链霉菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶与胰蛋白酶等处理后，再经透析能得到根本无蛋白质与小分子杂质的香菇多糖。酶解法就是指在浸提的过程中参加相应的酶来水解纤维素、果胶、蛋白质分子等，以使多糖从细胞中别离出来。 此环节影响多糖得率的主要因素有：酶用量、酶作用时间、作用温度和pH。酶的用量太少，不能彻底水解香菇细胞壁中的纤维素、果胶和细胞膜中的蛋白质，从 而不能使多糖从细胞

9、里更好的别离出来，降低多糖得率；酶太多，多糖量增加趋势趋于平缓，而造成原料的浪费酶制剂的作用时间也要适宜，过短，酶不能充分水解纤维素、果胶、蛋白质等，使得多糖得率降低；过长，多糖的量不会继续增加，同时浪费时间，造成生产上的不 必要浪费。当单因素考虑时，一般我们认为， 纤维素酶的最适反响浓度为 0.5% ,最适反响 时间为80min，最适反响温度为 50 C 一 60 C，最适pH为5.0;果胶酶的最适反响浓度为 0.5%，最适反响时问为 80min，最适反响温度为 35 C一 45 C，最适pH为4.5 ;木瓜蛋白 酶的最适反响浓度为 1.0%，最适反响时间为 60min，最适反响温度为 50

10、C一 60C，最适 pH 为 4.5。众所周知，温度和pH值会极大的影响酶的活性，高温、过酸、过碱，都会使酶失去活 性，这些都不利于酶活性的发挥。因此，具体的环境，我们应该通过实验找出最适酶用量， 作用时间，温度和pH值，这样不仅能达到香菇多糖的最大得率，而且省时，经济。除以上因素外，酶的类别和向预处理液参加不同酶的先后顺序也会影响香菇多糖的得 率。香菇细胞壁具有全透性，小分子物质如水、乙醇等与大分子物质如多糖、蛋白质等能自由出入；细胞膜具有半透性，只允许小分子物质通过。当细胞壁被水解后，细胞膜在一定条件下通过渗透吸水破裂，细胞内多糖等物质流出。同时，环境因素如pH、温度等也可使细胞膜破裂。当

11、用蛋白酶提取香菇多糖时，蛋白酶透过细胞壁， 与细胞膜接触，水解膜蛋白从而破坏膜结构，香菇多糖得以析出；当用纤维素酶处理时，在适宜条件下，细胞壁被水解，同时细胞膜由于吸水或外环境因素的影响而破裂，多糖类物质流出。一般情况下，用复合酶提取效果明显高于单酶的提取，这是因为香菇细胞壁主要由蛋白质、几丁质和纤维素等构成，很巩固；使用纤维素酶，果胶酶和蛋白酶先后水解，共同作用 于香菇的细胞壁，使其破裂，多糖易于从胞内释放，比单一酶作用提高了香菇多糖的得率。 但是，假如蛋白酶和纤维酶同时使用，由于各自的最适条件不同，不能达到最优水解效果， 同时蛋白酶对纤维素酶具有水解作用，所以有些文献报道双酶水解与用纤维素

12、酶单酶水解相比，效果没有明显提高。X宁和李健纤维素酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶分别两两组合成复合酶，研究其提取效果，结果如表1:表1复合酶提取香菇多糖复合酶纤维素酶+木瓜蛋白酶纤维素酶+中性 蛋白酶木瓜蛋白酶+纤维素酶中性蛋白酶+纤维素酶多糖得率%由此可知，木瓜蛋白酶的提取得率明显高于纤维素酶和中性蛋白酶的得率，其中尤以纤 维素酶+木瓜蛋白酶处理效果最优。木瓜蛋白酶也是目前所知道的一种十分适合香菇多糖提 取的酶，这是因为它有特殊结构：它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力。因此，复合酶解法是一种较好的提取法，很

13、有开展前景。在具体提取多糖时，应注意不同酶的选择与组合，同时结合相关环境条件，筛选制定出最优提取方案。2.4微波法提取香菇多糖微波提取法是一种新型提取法，由于溶剂与细胞液吸收微波能，微波射线辐射于溶剂并 透过细胞壁内部时，细胞内部温度升高压力增大，当压力超过细胞的承受能力时，细胞壁破裂，位于细胞内部的多糖就从细胞中释放出来4。在微波法提取多糖的实验中，影响多糖提取率的主要因素有：微波功率、提取时间以与提取次数等。随着微波功率的提高，加热速度增大，分子运动速度加快，渗透、扩散与溶解 速度加快；同时，高功率的微波引起细胞内部的结构变化，加速香姑多糖由外层细胞转移到溶液中。所以，随着提取功率的升高香

14、菇多糖的得率升高，当功率超过40%时，多糖增加趋势趋于平缓；当功率达到 60%左右时，多糖局部会被碳化。所以，微波功率一般为700W至900W。对微波作用时间而言，随着时间的延长，多糖得率先上升，而后又下降。这可能是因为微波辐射时间加长， 香菇多糖慢慢分解， 逐渐被氧化而造成多糖的损失。因此，微波作用时 间也很重要，应根据所用微波功率和处理的样品量来决定适当的作用时间。而微波提取的次数也会对其产率有一定的影响。 随着次数的增多，多糖得率增加，但到了一定程度后，变化 不大，考虑到提取次数增多，工艺操作复杂，水溶剂用量增加，过滤和浓缩困难，因此，提 取次数不宜过多，通常为 2至3次5。2.5超声波

15、提取法香菇多糖的超声波(20KHz-50MHz)提取一利用超声波的空化作用分散破坏植物组织，加速植物多糖成分的浸出提取；另外超声波产生的机械振动、孚L化和击碎效应等也能加速多糖 成分的扩散释放并充分与溶剂混合，提高香菇多糖的得率。另外，超声波破碎过程是一个物理过程，浸提过程中无化学反响发生，浸提的多糖的结构和性质不会发生变化。所以用超声波提取香菇多糖可大大地缩短提取时间，减少料液比和降低提取液的粘度，而提取液粘度的降低有利于超滤别离时降低浓差极化的影响，从而提高多糖得率。超声波提取香菇多糖应注意超声时间、超声温度、超声功率的选择：一般超声时间为 20-40min，超声温度为65C 70C，而最

16、优超声功率为 80W左右。目前，超声波逐渐被广泛应用于天然产物的提取，如超声波提取中草药有效成分如皂甙类、生物碱、黄酮类成份等。2.6深层发酵培养提取法%左右。因此在工业生产中，此法很具竞争优势。其发酵工艺与主要提取过程：香菇保藏菌种t斜面母钟t摇瓶菌种t种子罐培养液t发酵液t上清液胞外多糖）、菌丝体胞内多糖多糖的后续提取工艺同一般方法，只是胞外多糖提取时， 其浓缩液要进展透析处理，其他各步骤根本一样 。总之，该法生产周期大为缩短，在市场竞争中占据很大优势，符合现代工业生产方式。 香菇发酵较细菌，放线菌，酵母菌发酵时间长，极易感染杂菌，因此，工艺全过程的无菌控 制是深层发酵培养成败的关键。3香

17、菇多糖的别离纯化近年来采用超滤法（7）提取香菇多糖，可以降低本钱，提高产率，但产品纯度较低。超滤-渗滤法可改善产品纯度充分发挥膜别离技术的优势。在30 C, 0.3 MPa压力差下，用截留相对分子质量为50000的滤膜对香菇多糖提取液进展超滤渗滤纯化，用 Sevag法除去浓缩液中的蛋白质，然后冷冻枯燥，得到多糖制品。%，收率为1.59% ,而超滤纯化所得产品纯度仅为74.4%。超滤-渗滤纯化法与超滤纯化法相比，纯度提高了 8.1%，这是因为渗滤时浓缩液中的小分子糖类能够充分通过滤膜， 提高了制品的纯度。超滤-渗滤是一种有效的纯化香菇多糖的方法。3.2活性炭联合陶瓷膜超滤纯化香菇多糖超滤纯化所得

18、产品纯度可达 74.4% ,超滤-渗滤法所得多糖制品的纯度提高到80.4%,但实践证明有机膜始终存在着不能解决膜污染、不能抗高压和高温等问题。活性炭联合陶瓷膜超滤法先用活性炭预处理，再用陶瓷膜超滤法进展纯化精制。 采用适宜孔径的无机陶瓷膜超滤来纯化香菇多糖既表现了超滤无相变、无溶剂污染、容易保持生物分子的活性、操作简单可靠等优点，又可弥补有机膜的诸多缺点。以45 %的香菇多糖粗品为研究对象，用1%活性炭对香菇多糖粗品预处理后，采用截留分子量为50000的陶瓷膜超滤。超滤条件为温度 40 C、跨膜压差0.20MPa、膜面流速4.5m/ s。 在此条件下，多糖粗品脱色率达98.12 % ,蛋白质脱除率为81.10 %，多糖纯度从45 %提高到 89.17 %，收率为 77.16 %。4.结论通