红细胞渗透脆性实验

1、红细胞渗透脆性实验Measuring for erythrocyte osmotic fragility【教学对象与学时】一、教学对象：五年制本科二、学时：4学时【预习要求】预习红细胞生理特性【目的要求】一、 操作：学习用试管法测定红细胞渗透脆性二、 理论：1.了解红细胞渗透脆性实验的原理。2. 观察红细胞对不同渗透张力的细胞外溶液的抵抗力，进一步理解细胞外液渗透张力对维持红细胞正常形态与功能的重要性。【重点和难点】一、重点1. 准确配制不同渗透张力的溶液，掌握正确的红细胞渗透脆性测量方法。2. 理解红细胞渗透脆性实验的原理。二、难点1. 准确配制不同渗透张力的溶液。2. 掌握正确的红细胞渗透

2、脆性测量方法。【教学过程设计】1. 课前提问和预习检查。2. 讲解红细胞渗透脆性实验的原理。3. 介绍不同渗透张力溶液的配制法和抗凝血液的制备。4. 学生分组进行实验，观察红细胞对蒸馏水、1.9%尿素溶液和不同浓度的NaCl溶液的抵抗力。5. 实验结束前汇总全班实验结果，讨论实验结果，理解实验结果出现的原因。【课前预习检查或提问】一、 何谓红细胞渗透脆性？其正常值是多少？二、 影响红细胞渗透脆性的因素有哪些？【课前讲解】一、 实验设计的原理将红细胞悬浮于低渗盐溶液中，水将在渗透压的作用下渗入细胞，于是红细胞发生膨胀，由正常的双凹圆碟形(图1A)变成球形（图1B），并开始破裂而发生溶血。红细胞在

3、低渗盐溶液中发生膨胀破裂的现象称红细胞渗透脆性。但红细胞对低渗盐溶液具有一定的抵抗力，这种抵抗力的大小可作为衡量红细胞渗透脆性的指标。对低渗盐溶液抵抗力小，表示渗透脆性高；相反，则表示渗透脆性低。同一个体的红细胞对低渗盐溶液的抵抗力并不相同。将血液滴入不同浓度的低渗NaCl溶液中可检测其抵抗力的大小，刚开始出现溶血的NaCl溶液浓度为该血液中红细胞的最小抵抗力；出现完全溶血溶液浓度，为该血液中红细胞的最大抵抗力。前者代表红细胞的最大渗透脆性，后者代表红细胞的最小渗透脆性。生理学上将渗透压与血浆的渗透压相等的溶液称为等渗溶液；能使悬浮于其中的红细胞保持正常体积和形态的溶液称为等张溶液。等渗溶液不

4、一定是等张溶液，如1.9%的尿素溶液虽是等渗溶液，但不是等张溶液；而等张溶液溶液一定是等渗溶液，如浓度为0.85%的NaCl溶液既是等渗溶液又是等张溶液。 A B图1. 红细胞形态 (A:正常；B：低渗NaCl溶液中球形红细胞).二、实验方法1. 制备不同浓度的NaCl溶液。先配制1%浓度的低渗NaCl溶液100ml，然后取口径相同的干净小试管12支，编号排列在试管架上，按下表分别向各试管内加入1%NaCl溶液和蒸馏水后混匀，配制成12种0.68%0.24%不同浓度的低渗NaCl溶液(图2) 图2 用于配制低渗NaCl溶液的试管 表1 红细胞渗透脆性实验中不同浓度的NaCl溶液配制法试管编号

5、1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121%NaCl溶液（ml） 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6蒸馏水（(ml) 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9NaCl溶液浓度（%）0.68 0.64 0.60 0.56 0.52 0.48 0.44 0.40 0.36 0.32 0.28 0.242. 分别配制0.85%浓度的NaCl溶液、1.9%浓度的尿素溶液。另取3支小试管，编号1315，分别盛2.5ml 0.85%NaCl溶液、1.9%尿素溶液和蒸馏水。3. 碘酒

6、、酒精消毒皮肤后用灭菌干燥的、肝素湿润的注射器从肘正中静脉取血2ml（图3），立即混匀，将其中1ml加入试管，余血依次向15支试管内各加入1滴（图4），轻轻混匀。肘正中静脉图3. 上臂大静脉 图4. 向试管内加血示意图 4. 观察13、14、15管的变化，其余12管在室温下静置1小时，然后观察混合液的颜色和透明度。1） 试管内液体完全变成透明红色，说明红细胞全部破裂，称完全溶血（图5A）。2） 试管内液体下层为混浊红色，上层为透明红色，表示部分红细胞破裂，称不完全溶血（图5B）。3） 试管内下层为混浊红色，上层无色透明，说明红细胞全部没有破坏（图5C）。CBA 图5. 溶血程度示意图5. 记录

7、实验结果。包括受试者姓名和红细胞渗透脆性范围（即最小抵抗力的NaCl溶液浓度和最大抵抗力的NaCl溶液浓度）以及1315管的结果。6. 取第6管和第13管混合液各1滴于载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察红细胞形态。图6. 等渗NaCl溶液中红细胞形态 成败关键（注意事项） 1. 血液最好新鲜制备。 2. 准确配制不同浓度的低渗盐溶液。 3. 所有玻璃器皿要求干燥清洁。 4. 向试管内滴加血液时不可用力挤压，不可将血泡沫注入试管。混匀含红细胞的液体时动作应轻，以免造成溶血。 5. 观察溶血情况时以白色为背景。 6. 为使各管加血量相同，加血时持针角度应一致。 7. 各试管应准确编号。 8. 玻

8、璃器皿应小心轻放，以免损坏。【典型结果】1. 红细胞渗透脆性实验结果（表2） 表2 红细胞渗透脆性实验结果试管编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15结 果2. 第6管和第13管混合液中红细胞形态 第6管：第13管：【分析讨论】一、 结果分析二、 非预期结果及可能原因分析【参考结论】【实验报告要点】1. 列表记录红细胞渗透脆性实验结果。2. 记录第6管和第13管混合液中红细胞形态观察结果。3. 讨论结果产生的原理。4. 结论。【思考题】一、 为什么同一个体的红细胞渗透脆性有最大值和最小值？二、 红细胞在等渗的1.9%尿素溶液中会发生什么现象？为何出现这种现象

9、？【参考内容】一、红细胞渗透脆性实验的临床意义测定红细胞渗透脆性是一种生物学实验，它能够检测出红细胞膜对由于胞内水聚集所造成的物理牵张力的抵抗能力。这主要取决于红细胞表面积与其体积之比。表面积大而体积小对低渗盐水抵抗力较大(脆性较小)；反之，则脆性增加。正常参考值：0.46%0.42%的NaCl溶液开始溶血；0.34%0.32% 的NaCl溶液完全溶血。    患者与正常对照，溶血管的NaCl浓度相差0.4%具有诊断价值。从诊断学的观点来看，红细胞渗透脆性实验能分辨出以下两种不同的病理状态：红细胞渗透脆性增高见于：遗传性球形红细胞增多症，自身免疫性溶血性贫血伴继发

10、球形红细胞增多等。某些药物或过冷、过热也可引起。红细胞渗透脆性减低见于：缺铁性贫血，各型地中海贫血，镰形细胞贫血，脾切除，阻塞性黄疸等。二、红细胞渗透脆性实验的其他方法（一）红细胞孵育渗透脆性试验(RIOFT)本试验是将血液置37孵育24h后，进行渗透脆性试验。在孵育过程中，红细胞能源消耗，贮备的ATP减少，导致需要能量的红细胞膜对阳离子的主动传递受阻，造成钠离子在RBC内集聚，细胞膨胀，孵育渗透脆性增加。有细胞膜缺陷及某些酶缺陷的RBC能源很快耗尽，孵育渗透脆性明显增加。参考值：未孵育：50%溶血为0.40%0.45% NaCl溶液；37孵育24h：50%溶血为0.46%0.60% NaCl

11、溶液。临床意义 1.本试验用于轻型遗传性球形红细胞增多症、先天性非球形红细胞溶血性贫血的诊断和鉴别诊断。2.增加：见于遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、先天性非球形细胞溶血性贫血。3.减低：见于地中海贫血、缺铁性贫血、镰状细胞贫血、脾切除术后。（二）全自动智能红细胞脆性检测系统检测管放入RC，盖好，按OK，读数。全自动智能红细胞脆性检测系统是一种临检用红细胞脆性检测系统，包括红细胞脆性检测仪-ERYFRATEST READER及检测试剂-ERYFRATEST MONOTEST，可用于检测红细胞渗透脆性（EOF）和红细胞渗透阻力（EOR）。本系统采用红细胞脆性检测仪及M

12、onotest检测试剂盒进行体外红细胞渗透阻力的定量检测。微型、简易的红细胞脆性检测系统尽可在医生办公室、在病房、在病人床头使用。首次实现了取血数分钟内即可获得红细胞脆性定量结果。三、何谓地中海贫血？地中海贫血（Thalassemia）简称海贫或海洋性贫血，于 1925 年由 Cooley 和 Lee 首先描述，最早发现于地中海区域，当时称为地中海贫血，国外亦称海洋性贫血。实际上，本病遍布世界各地，以地中海地区、中非洲、亚洲、南太平洋地区发病较多。在我国以广东、广西、贵州、四川为多。这是一类由于常染色体遗传性缺陷，引起珠蛋白链合成障碍，使一种或几种珠蛋白数量不足或完全缺乏，因而红细胞易被溶解破

13、坏的溶血性贫血。我国自然科学名词审定委员会建议本病的名称为珠蛋白生成障碍性贫血，习惯上仍称为地中海贫血。呈小细胞低色素性贫血，红细胞大小不均，可见异形，靶形红细胞 (可有 0-66 ) ，网织红细胞增多。红细胞渗透脆性降低。有种族和家族史特征。【专业英语选读】Osmotic fragilityBeutler E,Lichtman M,Coller B,et al. Williams Hematology,5th ed .New Yock, McGraw-Hill, 19951. The osmotic fragility test is a simplified means of estima

14、ting the surface area/volume ratio of erythrocytes. As this ratio falls the cell becomes more sensitive to osmotic lysis. Its greatest usefulness is in the diagnosis of hereditary spherocytosis, but it has also been used in screening for thalassemia.2. Either heparinized or defibrinated blood is sui

15、table for osmotic fragility studies. 3. It is usually desirable to determine the osmotic fragility both of the freshly drawn blood and of autoincubated blood. For the latter, 2 ml of the sterile blood is placed in a sterile 5-ml screw-cap vial and incubated for 24 h at 37. A series of solutions cont

16、aining phosphate-buffered sodium chloride solutions equivalent in osmolarity from 0.15 to 0.80% NaCl are dispensed into tubes. A one-hundredth volume of blood is added to each tube, as well as to a tube containing distilled water, which serves as the blank. After being allowed to stand at room tempe

17、rature for 60 min, the tubes are centrifuged and optical density of the supernatant is read at 540 nm.4. The percent hemolysis in each tube is calculated as follows:% hemolysis = (ODs-ODB)×100 OdoWhere ODs is the optical density in a supernatant, ODB is the optical density of the 0.09% saline s

18、upernatant, and ODo is the optical density of the distilled water tube. 5. The normal range of values is presented as follows:NaCl, % Lysis, %Fresh Incubated0.20 95-1000.30 97-100 85-1000.35 90-99 75-1000.40 50-95 65-1000.45 5-45 55-950.50 0-6 40-850.55 0 15-700.60 0-400.65 0-100.70 0-50.75 06. Cells with a low surface area/cell volume ratio,demonstrate increased osmotic fragility; Cells with a high