第十一章_动物细胞培养与表达制备药用蛋白-我的课件

1、第十一章第十一章 动物细胞培养与表达制备药用动物细胞培养与表达制备药用蛋白蛋白主要内容主要内容 动物细胞培养概念与特点动物细胞培养概念与特点 体外培养细胞生长和增殖过程体外培养细胞生长和增殖过程 动物细胞小规模培养动物细胞小规模培养 动物细胞大规模培养动物细胞大规模培养 动物细胞表达制备药用蛋白动物细胞表达制备药用蛋白第一节第一节 动物细胞培养概念与历史动物细胞培养概念与历史 定义：定义： 动物细胞培养动物细胞培养是指将动物的体内组织是指将动物的体内组织取出，使其取出，使其分散成单个细胞，模拟体内的生理环境，在体外一定分散成单个细胞，模拟体内的生理环境，在体外一定的的条件下条件下( (无菌、适

2、当温度和一定的营养条件下无菌、适当温度和一定的营养条件下) )，使，使之存活、生长和增殖的技术。之存活、生长和增殖的技术。动物细胞培养动物细胞培养是动物细胞工程的重要技术基础：细胞是动物细胞工程的重要技术基础：细胞融合、单克隆抗体与杂交瘤技术、胚胎工程、干细胞融合、单克隆抗体与杂交瘤技术、胚胎工程、干细胞工程、动物克隆、动物细胞产品的大规模制备技术等工程、动物克隆、动物细胞产品的大规模制备技术等等都离不开。等都离不开。原代培养与传代培养原代培养与传代培养在动物细胞体外培养中，按照培养过程中培养物是否在动物细胞体外培养中，按照培养过程中培养物是否需要被分割后再培养，而将体外培养分为需要被分割后再

3、培养，而将体外培养分为原代培养原代培养或或称称初代培养初代培养(primary culture)(primary culture)和和传代培养传代培养，传代培，传代培养又称养又称继代培养继代培养(secondary culture)(secondary culture)。原代培养与传代培养原代培养与传代培养 原代培养原代培养是从机体取得材料开始，将培养物放置在体外生长环是从机体取得材料开始，将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物，直到第一次传代前的这一境中持续培养，中途不分割培养物，直到第一次传代前的这一培养过程。培养过程。 原代培养的培养物的结构形式分为两种，一种是利用小块组

4、织原代培养的培养物的结构形式分为两种，一种是利用小块组织或称为或称为组织块组织块(tissue block)(tissue block)进行培养，另一种是将机体组织进行培养，另一种是将机体组织分散后制成分散后制成单细胞单细胞进行培养（组织消化法）。进行培养（组织消化法）。 原代培养原代培养组织块原代培养组织块原代培养原代培养原代培养原代培养原代培养原代培养原代培养组织消化原代培养组织消化原代培养 在组织消化中，常用的消化酶包括胰蛋白酶、在组织消化中，常用的消化酶包括胰蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶的粗制品等。这胶原酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶的粗制品等。这些酶既可单独使用，又可联合使用。

5、因为粗制品常些酶既可单独使用，又可联合使用。因为粗制品常混杂有其他蛋白酶，所以粗制品通常比精制品更有混杂有其他蛋白酶，所以粗制品通常比精制品更有效，而精制品更具特异性，并且毒性小。效，而精制品更具特异性，并且毒性小。原代培养原代培养原代培养注意事项原代培养注意事项 虽然各种细胞培养需要满足不同的条件，但有几种条件虽然各种细胞培养需要满足不同的条件，但有几种条件是大多数原代培养共同需要的：在取材时需去除脂肪和坏是大多数原代培养共同需要的：在取材时需去除脂肪和坏死的组织；为减小对组织的损伤，需用锋利的器具；适死的组织；为减小对组织的损伤，需用锋利的器具；适度离心以去除用于解离的酶；由于原代培养组织

6、细胞的存度离心以去除用于解离的酶；由于原代培养组织细胞的存活率很低，故用于原代培养的细胞的密度应高于正常的传代活率很低，故用于原代培养的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度；营养丰富的培养基比单一的培养基培养的细胞密度；营养丰富的培养基比单一的培养基( (如，如，EaglesEaglesMEM)MEM)更可取；胚胎组织在原代培养中更易分离，更可取；胚胎组织在原代培养中更易分离，细胞较易存活，增殖速度较快，故比成年组织更可取。细胞较易存活，增殖速度较快，故比成年组织更可取。 随着原代培养物培养时间的延长、细胞分裂增殖的进随着原代培养物培养时间的延长、细胞分裂增殖的进行，培养物体积或密度会越来

7、越大，一方面可能会长行，培养物体积或密度会越来越大，一方面可能会长满培养空间，另一方面分裂增殖的细胞会互相接触而满培养空间，另一方面分裂增殖的细胞会互相接触而发生发生接触性抑制接触性抑制，生长速度逐渐减慢甚至停止。，生长速度逐渐减慢甚至停止。 接触抑制定义定义：细胞从接种到长细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，增多相互接触后，不再增殖。细胞不再增殖。细胞质膜质膜上上有糖蛋白有糖蛋白，也叫做糖被，它，也叫做糖被，它在细胞上起识别作用。当细胞增殖在细胞上起识别作用。当细胞增殖到一定程度，也就是互相挨在一起到一定程度，也就是互相挨在一起的时候，糖

8、蛋白识别了这种信息，的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖。就会使细胞停止继续繁殖。传代培养传代培养将细胞培养物分割成小的部分，重新接种到另外的将细胞培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿内，再进行培养，这个过程就称为培养器皿内，再进行培养，这个过程就称为传代培传代培养养(passage culture)(passage culture)。原则上，传代是以原代培养物原则上，传代是以原代培养物贴壁生长长满培养器贴壁生长长满培养器皿的生长面或者在悬浮培养状态下细胞密度足够大皿的生长面或者在悬浮培养状态下细胞密度足够大时进行时进行，但传代的具体时间并没有固定的时间，操，但传代的

9、具体时间并没有固定的时间，操作者可以根据具体情况安排传代时间。但是，提前作者可以根据具体情况安排传代时间。但是，提前或推后传代都不可取，尤其是后者。或推后传代都不可取，尤其是后者。 发展历史发展历史1 1、动物细胞（组织）培养技术的起源：、动物细胞（组织）培养技术的起源： 动物细胞培养的动物细胞培养的奠基人奠基人：美国生物学家哈里森（：美国生物学家哈里森（19071907年）用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚神经组年）用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚神经组织培养在淋巴液中，存活几周，有细胞突起的生长过织培养在淋巴液中，存活几周，有细胞突起的生长过程。程。 先驱者先驱者法国学者卡勒尔：设计

10、卡氏培养瓶自法国学者卡勒尔：设计卡氏培养瓶自19231923年用年用于培养鸡胚的心肌组织成功以后，已使多种动物组织于培养鸡胚的心肌组织成功以后，已使多种动物组织培养获得成功。培养获得成功。2 2、2020世纪世纪4040年代以后：年代以后： 动物组织培养的科学家们研究重点集中在动物组织培养的科学家们研究重点集中在培养基培养基方面。方面。3 3、2020世纪世纪8080年代以后：年代以后： 随着随着基因工程技术和细胞融合技术基因工程技术和细胞融合技术的迅速发展，的迅速发展，已能把特定的外源基因通过已能把特定的外源基因通过PCRPCR技术扩增几千倍，并技术扩增几千倍，并可转染到细胞内，使其得到高质

11、量的表达。可转染到细胞内，使其得到高质量的表达。 4 4、近年：、近年： 淋巴细胞杂交瘤技术，使动物细胞培养进入了一个淋巴细胞杂交瘤技术，使动物细胞培养进入了一个新领域。杂交瘤细胞能在体外悬浮情况下大量繁殖并产新领域。杂交瘤细胞能在体外悬浮情况下大量繁殖并产生单克隆抗体。生单克隆抗体。 随着随着基因重组和单克隆抗体技术基因重组和单克隆抗体技术的发的发展，动物细胞培养展现出越来越可观的工业化前景。展，动物细胞培养展现出越来越可观的工业化前景。第二节第二节 动物细胞培养的特点动物细胞培养的特点（一）动物细胞之间的连接特点：（一）动物细胞之间的连接特点： 1.1.紧密连接：牢固、无紧密连接：牢固、无

12、间隙。（封闭连接）间隙。（封闭连接） 2.2.间隙连接间隙连接：2-3nm2-3nm间隙。间隙。 （通讯连接）（通讯连接） 3.3.桥粒连接桥粒连接：有：有间隙，有纤维形成的间隙，有纤维形成的特殊结构特殊结构（锚定连接）（锚定连接） 动物细胞培养的特点动物细胞培养的特点（二）动物细胞的培养特点：（二）动物细胞的培养特点： 1.1.动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁。动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁。 2.2.动物细胞倍增时间长，生长缓慢，动物细胞倍增时间长，生长缓慢，易污染易污染。 3.3.培养过程需氧量少，对培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切力机械搅拌或剪切力敏感。敏感。 4.4.动物细胞间主

13、要以聚集体形式存在。动物细胞间主要以聚集体形式存在。 5.5.原代细胞一般繁殖原代细胞一般繁殖5050代左右代左右即退化死亡。即退化死亡。6.6.动物细胞对于营养条件更加苛刻，除一般的营养物动物细胞对于营养条件更加苛刻，除一般的营养物质外，还需要质外，还需要血清血清。7.7.适应性差适应性差, , 对于对于培养环境很培养环境很敏感敏感，如，如pHpH，溶解氧，溶解氧，温度，剪切力等。温度，剪切力等。8.8.绝大多数绝大多数哺乳动物细胞只有贴附在固体或半固体的哺乳动物细胞只有贴附在固体或半固体的表面才能表面才能生长。生长。辨析：辨析： 概念概念动物组织培养动物组织培养(tissue cultur

14、e)(tissue culture)是指从动物体内取出组是指从动物体内取出组织并模拟体内生理环境，使之在体外人工条件下生存织并模拟体内生理环境，使之在体外人工条件下生存和生长，并维持其结构和功能不变的技术。和生长，并维持其结构和功能不变的技术。动物器官培养动物器官培养(organ culture)(organ culture)的培养对象是整个器官的培养对象是整个器官或器官的一部分或器官的一部分，是在模拟体内的生理环境，使之在是在模拟体内的生理环境，使之在体外存活、生长和保持一定功能的技术体外存活、生长和保持一定功能的技术。 体外培养细胞的分型体外培养细胞的分型 贴附和非贴附生长：贴附和非贴附生

15、长： 1.1.贴附型细胞：细胞间相互接触；细胞与细胞外基贴附型细胞：细胞间相互接触；细胞与细胞外基质（培养器皿壁或载体）结合。多数细胞属贴附型细质（培养器皿壁或载体）结合。多数细胞属贴附型细胞。胞。 2.2.非贴附型细胞：此类细胞体外生长不必贴壁，可非贴附型细胞：此类细胞体外生长不必贴壁，可在培养液中悬浮生长。如：白细胞、淋巴细胞，肿瘤在培养液中悬浮生长。如：白细胞、淋巴细胞，肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等。细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等。细胞贴壁过程细胞贴壁过程贴附型细胞贴附型细胞(anchorage-dependent cell)(anchorage-dependent cell) 哺

16、乳动物大多数细胞必须附着固体哺乳动物大多数细胞必须附着固体表面生长，当表面生长，当细细胞布满表面（单层）时，即停止生长。若取走一胞布满表面（单层）时，即停止生长。若取走一片细片细胞，存留胞，存留的细胞就会沿着表面生长而重新布满表面的细胞就会沿着表面生长而重新布满表面。从。从生长表面生长表面脱落而进入液体的细胞通常不再生长而脱落而进入液体的细胞通常不再生长而逐渐退逐渐退化。按化。按培养细胞的形态培养细胞的形态，可分四，可分四类：类： 1.1.成纤维型细胞成纤维型细胞(fibroblast)(fibroblast) 外形与体内成纤维细胞相似，梭形或不规则形。细外形与体内成纤维细胞相似，梭形或不规则

17、形。细胞贴壁后呈梭形，胞质外伸出胞贴壁后呈梭形，胞质外伸出2-32-3个长短不同的突起，成个长短不同的突起，成放射状，胞间疏松。起源于中胚层的细胞在体外培养时放射状，胞间疏松。起源于中胚层的细胞在体外培养时一般表现为这种形式。一般表现为这种形式。 成纤维细胞型成纤维细胞型 名称：名称：凡在凡在培养中形态与成纤维细胞类似培养中形态与成纤维细胞类似的的来源：来源：由由中胚层起源中胚层起源的组织如：真正的成纤维细胞：心肌，平滑的组织如：真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮肌，成骨细胞，血管内皮。形态：形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞似体内成纤维细胞的形态，胞体梭

18、形或不规则三角形，胞 质向外伸出质向外伸出2323个长短不等的突起，中有卵圆形核个长短不等的突起，中有卵圆形核。生长特点：生长特点：排列成放射状，漩涡状，排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片并不紧靠连成片，细胞，细胞细细胞接触易断开而胞接触易断开而单独行动，单独行动，游离的游离的单独的单独的成纤维样细胞，常有几成纤维样细胞，常有几个个伸长的细胞突起伸长的细胞突起。2. 2. 上皮型细胞上皮型细胞(epithelium)(epithelium)： 泛指泛指形状上类似上皮细胞的细胞。特点：扁平状，形状上类似上皮细胞的细胞。特点：扁平状，形态较为规则。胞间紧密，单层贴壁。起源于内、外胚形态较为规则。

19、胞间紧密，单层贴壁。起源于内、外胚层的细胞体外培养时如此。层的细胞体外培养时如此。 上皮细胞型上皮细胞型生长特点：生长特点：易相易相连成片，紧密相连成片，紧密相连成连成薄层薄层-铺路铺路石状生长，呈膜石状生长，呈膜状移动，很少脱状移动，很少脱离细胞群而单个离细胞群而单个活动。活动。 体外培养细胞类型体外培养细胞类型上皮细胞型上皮细胞型3. 3. 游走型细胞游走型细胞(wandering)(wandering)： 类似巨噬细胞样的特征。外形不规则，分散生长，类似巨噬细胞样的特征。外形不规则，分散生长，不连接成片或形成群落；通常伸出伪足和突起，不连接成片或形成群落；通常伸出伪足和突起，贴壁贴壁位置

20、不固定，呈活跃的游走和变形运动位置不固定，呈活跃的游走和变形运动。单核巨噬细。单核巨噬细胞系细胞体外培养常如此：颗粒性白细胞、淋巴细胞、胞系细胞体外培养常如此：颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞。单核细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞。4.4.多形型细胞多形型细胞( polymorphic)( polymorphic)：形态上不规则（难以确定其形态）的细胞。细胞胞体形态上不规则（难以确定其形态）的细胞。细胞胞体略呈多角形；细胞胞突细长形；类似丝状伪足。如神略呈多角形；细胞胞突细长形；类似丝状伪足。如神经元和神经胶质细胞。经元和神经胶质细胞。贴壁依赖性细胞 非贴附型细胞或悬浮型细胞（非贴

21、附型细胞或悬浮型细胞（suspend cellsuspend cell） 见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。量繁殖。 概念：概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长使保持悬浮状态下生长 来源：来源：自血，脾或骨髓，血中白细胞癌肿细胞自血，脾或骨髓，血中白细胞癌肿细胞 特点：特点：在悬浮中生长良好，细胞圆形，单个或小细胞团在悬浮中生长良好，

22、细胞圆形，单个或小细胞团 优点：优点：生存空间大，提供数量大，传代方便生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化不需消化)，易，易于收获，可获得稳定状态于收获，可获得稳定状态 缺点：缺点：纯化不方便，不能通过离心将死、活细胞分离纯化不方便，不能通过离心将死、活细胞分离 有些细胞既可悬浮，也可以贴附。有些细胞既可悬浮，也可以贴附。影响细胞形态的主要因素影响细胞形态的主要因素 细胞的来源不同；细胞的来源不同； 生理条件不同，功能状态不同；生理条件不同，功能状态不同； 血清成分、培养基成分、血清成分、培养基成分、 添加成分、培养基添加成分、培养基的酸的酸碱度碱度、气体环境、温度等不同。、气体环境、温

23、度等不同。 如如HeLaHeLa细胞原本是一种上皮型癌细胞，但若在过酸或细胞原本是一种上皮型癌细胞，但若在过酸或过碱的条件下培养，可以呈现梭形，当酸碱适中时又过碱的条件下培养，可以呈现梭形，当酸碱适中时又可以恢复上皮型特征。可以恢复上皮型特征。 体外培养细胞的生长特性体外培养细胞的生长特性1 1、贴附：、贴附： 细胞接种后很快形成伪足，与底物点接触，细胞细胞接种后很快形成伪足，与底物点接触，细胞逐渐呈放射状伸展，细胞体中心变扁平状。逐渐呈放射状伸展，细胞体中心变扁平状。 影响因素：低钙不利于细胞伸展；低温和培养液影响因素：低钙不利于细胞伸展；低温和培养液流动过快妨碍贴附；生物因素：表皮生长因子

24、、成纤流动过快妨碍贴附；生物因素：表皮生长因子、成纤维细胞生长因子（减少细胞的扁平度）。维细胞生长因子（减少细胞的扁平度）。细胞的贴附延展过程细胞的贴附延展过程体外培养细胞的生长特性体外培养细胞的生长特性2 2、接触抑制、接触抑制（contact inhibitioncontact inhibition）：）： 正常细胞移动、靠近而接触时，细胞不再移动且正常细胞移动、靠近而接触时，细胞不再移动且停止接触区质膜的皱褶活动和细胞运动以及细胞的重叠停止接触区质膜的皱褶活动和细胞运动以及细胞的重叠生长。肿瘤（癌）细胞无此现象。生长。肿瘤（癌）细胞无此现象。3 3、密度抑制、密度抑制（density i

25、nhibitiondensity inhibition）：）： 只要营养充分，接触抑制的细胞仍能分裂增殖。但只要营养充分，接触抑制的细胞仍能分裂增殖。但细胞密度进一步加大、营养减少、代谢产物增多时，细胞密度进一步加大、营养减少、代谢产物增多时，细胞分裂停止，出现接触抑制。细胞分裂停止，出现接触抑制。第三节第三节 培养工具和条件培养工具和条件一、培养工具一、培养工具1. 1. 器皿或设备：器皿或设备：2. 2. 载体：微球（微载体）载体：微球（微载体） COCO2 2培养箱培养箱多孔塑料多孔塑料 培培 养养 板板二、培养条件：二、培养条件：1. 1. 温度：温度：2. pH2. pH：3. 3.

26、 气体：气体：4. 4. 培养基：培养基：1 1、温度：、温度：无论来源于何种有机体的细胞培养都需要一个与体无论来源于何种有机体的细胞培养都需要一个与体内生存环境尽可能一致的生长条件，其中最基本的条件之一内生存环境尽可能一致的生长条件，其中最基本的条件之一是恒定的适宜的温度环境。是恒定的适宜的温度环境。 人和大多数哺乳动物培养细胞的人和大多数哺乳动物培养细胞的最适温度最适温度在在3737左右。左右。培养细胞对培养细胞对低温低温的耐受力比对的耐受力比对高温高温强。强。 细胞培养在细胞培养在39394040中中1 h1 h，即会受到一定损伤，但仍能，即会受到一定损伤，但仍能恢复。当在恢复。当在41

27、414242的温度条件下培养的温度条件下培养1 h1 h，细胞则会受，细胞则会受到严重损伤，但不致于全部死亡，部分仍可能恢复。到严重损伤，但不致于全部死亡，部分仍可能恢复。当温当温度达度达4343以上时，细胞大多死亡。以上时，细胞大多死亡。 温度低于正常范围的环境，总的来说，只要温度不低于温度低于正常范围的环境，总的来说，只要温度不低于00时，时，低温只能抑制细胞代谢，并无伤害作用低温只能抑制细胞代谢，并无伤害作用。 在降到冰点以下时，细胞因胞外和胞质结冰而受损死亡在降到冰点以下时，细胞因胞外和胞质结冰而受损死亡。但若向培养液中加入但若向培养液中加入甘油或二甲亚砜甘油或二甲亚砜等保护剂，等保护

28、剂，防止胞内防止胞内结晶冰刺破胞膜结晶冰刺破胞膜，可用于细胞种子长期冻存，冻细胞时候，可用于细胞种子长期冻存，冻细胞时候常用常用慢速冻融法慢速冻融法。2 2、pHpH：最适最适7.2-7.47.2-7.4，多数细胞对酸性耐受力较强。，多数细胞对酸性耐受力较强。 细胞内、外细胞内、外pHpH调节是哺乳动物细胞和机体生存的基本调节是哺乳动物细胞和机体生存的基本条件。条件。pHpH不仅对维持离子平衡，而且对保持细胞的最不仅对维持离子平衡，而且对保持细胞的最佳酶功能状态和激素及生长因子对细胞表面受体的亲佳酶功能状态和激素及生长因子对细胞表面受体的亲和力都很重要。和力都很重要。 造成培养基造成培养基 p

29、H pH 波动的主要物质是细胞代谢产生的波动的主要物质是细胞代谢产生的COCO2 2, ,在封闭式培养过程中在封闭式培养过程中COCO2 2与水结合产生碳酸，培与水结合产生碳酸，培养基养基pHpH很快下降。很快下降。 大多数培养液设计的大多数培养液设计的pHpH为为7.07.07.7.4 4，最适宜是，最适宜是7.27.2，不同的细胞类型可能有一个小的最适不同的细胞类型可能有一个小的最适pHpH变化范围，细变化范围，细胞能够耐受胞能够耐受pHpH在这个范围内的偏离，大多数细胞能耐在这个范围内的偏离，大多数细胞能耐受的培养液受的培养液pHpH范围为范围为6.6.8 87.7.6 6，超出这一范围

30、可能会，超出这一范围可能会致死细胞致死细胞。 3 3、气体、气体O O2 2: :参与细胞的能量代谢，为细胞生命活动提供能参与细胞的能量代谢，为细胞生命活动提供能量，细胞呼吸，利于生物氧化，促进生长。量，细胞呼吸，利于生物氧化，促进生长。COCO2 2: :维持培养液的维持培养液的pH (pH (细胞耐酸细胞耐酸 耐碱）；耐碱）；COCO2 2主要与主要与维持培养液的酸碱度有直接关系维持培养液的酸碱度有直接关系。 大多数体外培养的气相环境为含大多数体外培养的气相环境为含5 5的的COCO2 2和和9595空空气的混合气体，其中氧浓度为气的混合气体，其中氧浓度为2121。必要时，可通。必要时，可

31、通入入N N2 2以稀释以稀释O O2 2，调节培养箱内，调节培养箱内O O2 2的浓度。的浓度。 4 4、培养基：、培养基：需要糖、氨基酸、维生素、辅酶、需要糖、氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌呤、嘧啶、激素和生长因子。核酸、嘌呤、嘧啶、激素和生长因子。 离体细胞与体内的细胞在营养代谢上是有区别的。离体细胞与体内的细胞在营养代谢上是有区别的。机体内的细胞营养可受神经和激素等进行一系列机体内的细胞营养可受神经和激素等进行一系列的统一调节，而离体的细胞则不受其调节。的统一调节，而离体的细胞则不受其调节。 体外培养细胞的生长所需的基本营养物质，除碳体外培养细胞的生长所需的基本营养物质，除碳水化合物、

32、氨基酸和脂类三大类营养物质外，也水化合物、氨基酸和脂类三大类营养物质外，也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素等。需要一定量的无机盐、维生素和微量元素等。细胞培养的条件细胞培养的条件 培养基组成成分培养基组成成分 糖糖：葡萄糖：葡萄糖 无机离子与微量元素无机离子与微量元素 ：如铁、锌、硒、铜、锰、钼、：如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒钒 氨基酸氨基酸：必需氨基酸：必需氨基酸: :缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸、赖氨酸。苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸、赖氨酸。 维生素：维生素：至少至少8 8种，生物素、叶酸、烟酰胺、种，生物素、叶酸、烟酰胺、泛

33、酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素维生素12。 促生长因子及激素促生长因子及激素：如胰岛素（：如胰岛素（insulininsulin），），它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。其它有生它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。其它有生长激素，多种生长因子等。长激素，多种生长因子等。细胞的营养需要细胞的营养需要培养基培养基 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分液，分天然培养基、合成培养基和无血清培养基。天然培养基、合成培养基和无血清培养基。 天然培养基天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和天然培养基有血

34、清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限，成分复杂，影响对某些实验产物的缺点：来源受限，成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析，易发生支原体污染。提取和实验结果的分析，易发生支原体污染。 组织培养技术建立的早期，体外培养细胞都是利用天然组织培养技术建立的早期，体外培养细胞都是利用天然培养基。培养基。 天然培养基含有天然培养基含有丰富的营养物质丰富的营养物质，渗透压、，渗透压、pHpH等也与体等也与体内环境相似，但制作过程复杂、内环境相似，但制作过程复杂、批间差异大批间差异大，因此逐渐，因此逐渐

35、为合成培养基所替代。为合成培养基所替代。 目前仍然广泛使用的天然培养基是血清目前仍然广泛使用的天然培养基是血清，另外组织提取，另外组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞时液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞时也不可缺少。也不可缺少。天然培养基天然培养基( (组成组成= =平衡盐液平衡盐液+ +天然动物成分天然动物成分) ) 血清：血清：提供营养和生长因子，促进细胞生长繁提供营养和生长因子，促进细胞生长繁殖，粘附及中和有毒物质殖，粘附及中和有毒物质。-纤维蛋白原纤维蛋白原 血浆：血浆：支持培养组织块及供给细胞生长的营养支持培养组织块及供给细胞生长的营养物质，现在不常用物

36、质，现在不常用。 组织浸出液：组织浸出液：可用鸡胚胎浸出液，含大分子核可用鸡胚胎浸出液，含大分子核蛋白质和小分子氨基酸，能促进细胞生长蛋白质和小分子氨基酸，能促进细胞生长。 水解乳蛋白：水解乳蛋白：氨基酸含量高，由乳蛋白质经水氨基酸含量高，由乳蛋白质经水解得到淡黄色粉末，一般可配制成解得到淡黄色粉末，一般可配制成0.5%0.5%溶液。溶液。血清中含有：血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种金属离子多种金属离子激素激素促贴附物质，如纤粘蛋白、胶原等。促贴附物质，如纤粘蛋白、胶原等。各种生长因子各种生长因子转移蛋白转移蛋白不明成分不明成分 血清

37、质量好坏是实验成败的关键。血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。一般使用的为一般使用的为小牛血清小牛血清，小牛血清取自出生，小牛血清取自出生10103030天的小牛。天的小牛。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。无细菌、支原体、病毒污染。 大部分血清在大部分血清在使用之前使用之前必须经过必须经过灭活处理灭活处理，即，即56放置放置30分钟。分钟。（灭活的目的是去除

38、血清中的补体（灭活的目的是去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生毒害作用。灭活也会损失一成分，避免补体对细胞产生毒害作用。灭活也会损失一些对细胞有利的成分如生长因子，因此些对细胞有利的成分如生长因子，因此也有人提出血清也有人提出血清不经灭活直接用于培养不经灭活直接用于培养 ） 储存条件储存条件 ： 血清一般储存于血清一般储存于-20，同时应避免，同时应避免反复冻融。可灭活后分装，反复冻融。可灭活后分装，使用时使用时4融化融化。 一般说来含一般说来含5 5小牛血清的培养基对大多数细胞小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加1010

39、血清。血清。 对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚。但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚。 血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。因子的综合反应。合成培养基合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法

40、模拟用人工方法模拟合成的。合成的。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定；成本低优点：标准化生产，组分和含量相对固定；成本低 缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长 需要。需要。 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血血清清）。）。MM培养基：培养基：基本培养基（基本

41、培养基（minimal medium）/通用培养基，通用培养基，是指适合多种细胞培养，未添加血清的合成培养基。是指适合多种细胞培养，未添加血清的合成培养基。MEM培养基：培养基：最低限度基本培养基（最低限度基本培养基（minimal essential medium）/低限量低限量Eagle培养基培养基DMEM培养基：培养基：Dulbeccomodified eagle mediumRPMI-1640：由美国由美国Roswell Park memorial Institute研发，研发，1640是培养基代号是培养基代号SFM：无血清培养基（无血清培养基（serum free medium）无血

42、清培养基无血清培养基 无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必必需因子需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。 无血清培养基由无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分基础培养基和替代血清的补充成分组成。组成。 19751975年，年，SatoSato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近近2020多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。生长和增殖。 无血

43、清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。产物的程序。 向无血清培养液中添加能促进细胞系生长的补加物向无血清培养液中添加能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。细胞株，所需补加物也不同。 无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。无血清培养基尚

44、处于研究阶段，难以推广。 目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清。清。 常用溶液常用溶液1、平衡盐溶液：（平衡盐溶液：（balanced salt solution,BSS） 主要由主要由无机盐、葡萄糖无机盐、葡萄糖组成组成 。作用：作用： 具有维持渗透压，调控酸、碱平衡的作用具有维持渗透压，调控酸、碱平衡的作用 提供细胞生存所需的能量和无机离子成分提供细胞生存所需的能量和无机离子成分 用于洗涤组织、细胞用于洗涤组织、细胞 配制各种培养用液配制各种培养用液 几种常用的平衡盐溶液几种常用的平衡盐溶液 ： Ringer PBS Earle Han

45、ks D-Hanks Dulbecco平衡盐溶液（BSS,balance salt solution）要求：要求：和培和培养物来源的动养物来源的动物血清相似物血清相似等渗等渗2、pH调整液调整液 NaHCONaHCO3 3溶液（常用溶液（常用5.6%5.6%或或7.4%7.4%的的NaHCONaHCO3 3溶液）溶液） HEPESHEPES液（液（HEPESHEPES是一种弱酸，中文名称是羟乙基哌嗪是一种弱酸，中文名称是羟乙基哌嗪乙硫磺酸，使用的终浓度为乙硫磺酸，使用的终浓度为0.010.010.05mol/L0.05mol/L；可维；可维持持pHpH在在7.07.0左右）。左右）。3 3、细

46、胞消化液、细胞消化液 胰蛋白酶溶液（胰蛋白酶溶液（0.1%0.5，pH8.0） 胶原酶溶液（胶原酶溶液（0.10.3mgL或或200UmL，pH6.5） EDTA溶液（溶液（0.02%） 上述溶液可混合使用上述溶液可混合使用4、抗生素液、抗生素液 常用的是常用的是青链霉素青链霉素，俗称，俗称“双抗溶液双抗溶液”。青霉素主要。青霉素主要对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。 青霉素使用的终浓度为青霉素使用的终浓度为100000U/L，链霉素使用的终，链霉素使用的终浓度为浓度为0.1g/L。一般配制成。一般配制成100倍浓缩液，可用倍浓缩液，可

47、用PBS配制。配制。5、谷氨酰胺补充液、谷氨酰胺补充液 谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，是合成培养谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，是合成培养基的重要成分。基的重要成分。 由于谷氨酰胺容易降解，所以都是在由于谷氨酰胺容易降解，所以都是在使用前添加使用前添加。 谷氨酰胺使用谷氨酰胺使用终浓度为终浓度为0.002mol/L。一般配制为。一般配制为100倍浓缩液，配制时应加温至倍浓缩液，配制时应加温至30，完全溶解后过滤除，完全溶解后过滤除菌，分装至小瓶，储存于菌，分装至小瓶，储存于-20。1 1）原代培养期）原代培养期2 2）传代培养期）传代培养期3 3）衰退期）衰退期第四节第四节 体外培养

48、细胞的生长与增殖过程体外培养细胞的生长与增殖过程(1)(1)原代培养原代培养(primary culture)期亦称初代培期亦称初代培养期。为新鲜组织自体内取出接种培养至第一次传代养期。为新鲜组织自体内取出接种培养至第一次传代的阶段的阶段, ,一般持续一般持续1414周。周。特点：原代细胞培养通常为异质性，细胞独立生特点：原代细胞培养通常为异质性，细胞独立生存性差，多呈二倍体核型，更能代表其来源组织的细存性差，多呈二倍体核型，更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性，是检测药物的很好实验工具。胞类型及组织特异性，是检测药物的很好实验工具。(2)(2)传代期传代期: :当原代培养的细胞相互汇合时

49、，细胞由当原代培养的细胞相互汇合时，细胞由原培养瓶消化、收集、稀释后传到新的培养瓶的过程。原培养瓶消化、收集、稀释后传到新的培养瓶的过程。特点特点: :在细胞整个生命期中此期的持续时间最长，一般在细胞整个生命期中此期的持续时间最长，一般为为30503050代，能维持二倍体核型，特性稳定，一般原代，能维持二倍体核型，特性稳定，一般原代、代、5 5代、代、1010代冻存代冻存. .(3)(3)衰退期，此期细胞虽仍存活，但增殖基本停止衰退期，此期细胞虽仍存活，但增殖基本停止，细胞形态轮廓增强，进而细胞发生衰退、死亡。，细胞形态轮廓增强，进而细胞发生衰退、死亡。细胞在第二期末或第三期初阶段，通过所谓细

50、胞在第二期末或第三期初阶段，通过所谓“危危机期机期”(crisis)(crisis)，获得不死性而具有持久或无限增殖的，获得不死性而具有持久或无限增殖的能力，失去接触抑制。能力，失去接触抑制。培养细胞传代的生存期：培养细胞传代的生存期：1)1)滞留期滞留期(latent phase) (latent phase) 2)2)指数生长期指数生长期(logarithmic growth phase)(logarithmic growth phase)又称又称对数期对数期-试验用试验用3)3)平台期又称生长停滞期平台期又称生长停滞期(stagnate phase)(stagnate phase)。 -

51、 -传代传代原代培养与传代培养技术原代培养与传代培养技术原代培养原代培养1 1、组织块培养、组织块培养 处死动物，无菌取组织块入小烧杯中，用眼科剪处死动物，无菌取组织块入小烧杯中，用眼科剪刀将组织块剪碎，吸管吸取刀将组织块剪碎，吸管吸取HanksHanks液冲下剪刀上液冲下剪刀上的碎的碎片，补片，补加加3-5mLHanks3-5mLHanks液，用吸管轻轻吹打，液，用吸管轻轻吹打，低速离低速离心心，弃去弃去上清液，留下组织块。上清液，留下组织块。2 2、组织消化培养、组织消化培养（1 1）取材、分离、消化）取材、分离、消化 消化软组织：消化软组织：0.25%0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶 消化纤维

52、组织：消化纤维组织：0.1-0.3mg/ml0.1-0.3mg/ml胶原酶胶原酶 消化传代细胞（制成细胞悬液）：消化传代细胞（制成细胞悬液）：EDTA+EDTA+胰蛋白酶胰蛋白酶（2）培养与检查：培养与检查： 接种：接种量大小视情况而定；防污染；常规检查接种：接种量大小视情况而定；防污染；常规检查：1-1-2 2天天做一次。做一次。传代培养：传代培养： 原代细胞分裂增殖成片，布满器皿表面时，则需原代细胞分裂增殖成片，布满器皿表面时，则需对其分离进行重新培养。对其分离进行重新培养。 传代技术的关键：传代技术的关键： 1.1.传代时机：传代时机：80-90%80-90%汇合时最好（过早：细胞汇合时

53、最好（过早：细胞产量不足产量不足 过晚：细胞健康不佳）。过晚：细胞健康不佳）。 2.2.酶消化的方法和细胞对酶的反应：酶消化的方法和细胞对酶的反应：敏感敏感/ /迟钝迟钝（酶作用时间和方法，细胞的类型和来源）（酶作用时间和方法，细胞的类型和来源）第五节第五节 细胞株与保存细胞株与保存 细胞株细胞株: :通过选择法或克隆法从原代培养物或细胞系中获得通过选择法或克隆法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志的培养物。具有特殊性质或标志的培养物。 克隆培养法克隆培养法( (单细胞分离培养法单细胞分离培养法):):把从细胞悬液中获得的单把从细胞悬液中获得的单个细胞用于培养个细胞用于培养, ,使之分

54、裂增殖而产生一个细胞群的方法使之分裂增殖而产生一个细胞群的方法. . 细胞系细胞系: :原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。 有限细胞系有限细胞系: :不能连续培养，体外生存期有限不能连续培养，体外生存期有限 无限细胞系无限细胞系: :持续生存持续生存, , 具无限繁殖力，本质上发生改变的具无限繁殖力，本质上发生改变的细胞。细胞。细胞株的分类细胞株的分类 原代细胞原代细胞 二倍体细胞二倍体细胞 连续细胞系连续细胞系 融合细胞和重组细胞融合细胞和重组细胞 CHO细胞 Vero细胞 BHK-21细胞 WI-38细胞常用细胞株常用细胞株1 1）冻存和复苏的原则

55、：慢冻快融）冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶生大的冰晶；相反，结晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞就大，大结晶会造成细胞膜膜、细胞器、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶冰晶的重结晶。 细胞冻存保存和复苏技术

56、细胞冻存保存和复苏技术2 2）慢冻程序）慢冻程序标准程序：标准程序： 当温度在当温度在-25 -25 以上时，以上时， 1 12 /min2 /min 当温度达当温度达-25 -25 以下时，以下时， 5 510 /min10 /min 当温度达当温度达-100-100时，可迅速放入液氮中时，可迅速放入液氮中细胞冻存简易程序：细胞冻存简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1 122的速度，在的速度，在4040分钟内降至

57、液氮表面，停分钟内降至液氮表面，停3030分钟后，直分钟后，直接投入液氮中。接投入液氮中。3 3）低温保护剂的应用）低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是常用的低温保护剂是DMSODMSO，它是一种渗透性保护剂，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高质膜对水的通透性，降低冰点，可迅速透入细胞，提高质膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减

58、少冰晶对细胞的损伤。胞的损伤。4 4）细胞冻存方法）细胞冻存方法1 1 预先配制冻存液：预先配制冻存液： 含含20%20%血清培养基血清培养基10%DMSO 10%DMSO 2 2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液存液, , 用吸管吹打制成细胞悬液（用吸管吹打制成细胞悬液（1 110106 6 5 5 10106 6细胞细胞/ml)/ml)3 3 加入加入1ml1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。名称和冷冻日期。4 4 缓慢放入液氮罐中冻存。缓慢放入液氮罐中冻存。5 5）细胞复苏方法）

59、细胞复苏方法l l 从液氮中取出冷冻管，迅速投入从液氮中取出冷冻管，迅速投入37373838水浴中，水浴中，使其融化（使其融化（1 1分钟左右）。分钟左右）。2 52 5分钟内用培养液稀释至原体积的分钟内用培养液稀释至原体积的1010倍以上。倍以上。3 3 低速离心低速离心1010分钟。分钟。4 4 去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。第六节第六节 动物细胞小规模培养动物细胞小规模培养 悬滴培养悬滴培养 灌注小室培养灌注小室培养 培养瓶培养培养瓶培养 培养板培养培养板培养 转管培养转管培养 转瓶培养转瓶培养单盖玻片悬滴培养法单盖玻片悬滴培养法将培养液滴于

60、盖玻片上并将培养液滴于盖玻片上并铺展开铺展开将待培养的组织块铺展于将待培养的组织块铺展于培养液中央培养液中央将盖玻片翻转放于凹载玻将盖玻片翻转放于凹载玻片上，密封片上，密封贴壁贴壁2424小时内，细胞就能小时内，细胞就能从组织块四周游走从组织块四周游走适用于组织量少的适用于组织量少的原代培养原代培养双盖玻片悬滴培养法双盖玻片悬滴培养法 方法和前面基本相同。不同点：取一载体盖玻片，在其方法和前面基本相同。不同点：取一载体盖玻片，在其上滴一滴大小适当的消毒蒸馏水。将带有组织块的盖玻上滴一滴大小适当的消毒蒸馏水。将带有组织块的盖玻片的无组织一面贴到载体盖玻片上，借助水滴的扩展，片的无组织一面贴到载体