疟原虫镜检技术120228

1、泗阳县人民医院检验科泗阳县人民医院检验科 王恒松王恒松疟原虫镜检技术疟原虫镜检技术l疟原虫的基本形态特征疟原虫的基本形态特征l血片制作与染色血片制作与染色l疟原虫计数疟原虫计数l显微镜的维护与保养显微镜的维护与保养 疟疾是由蚊子传播的寄生虫病，它的病疟疾是由蚊子传播的寄生虫病，它的病原体是疟原虫。原体是疟原虫。 寄生于人体的疟原虫有寄生于人体的疟原虫有4 4 种种疟原虫基本结构疟原虫基本结构n疟原虫基本构造为疟原虫基本构造为核、细胞质（胞浆）和疟核、细胞质（胞浆）和疟色素。色素。n原虫经原虫经姬氏姬氏GiemsaGiemsa或瑞氏或瑞氏WrightWright染色：染色： 核核呈呈红色红色,

2、,胞质胞质呈呈兰色兰色，疟色素疟色素为本色为本色胞浆胞浆疟色素疟色素核核疟原虫基本结构疟原虫基本结构2.2.细胞浆细胞浆 蓝色或深蓝色，随着虫体发育长大，蓝色或深蓝色，随着虫体发育长大，细胞浆逐渐增多。细胞浆逐渐增多。疟原虫基本结构疟原虫基本结构胞浆胞浆疟原虫基本结构疟原虫基本结构n不着色，颜色和颗粒的形状，因疟原虫种类而不着色，颜色和颗粒的形状，因疟原虫种类而异，疟色素在虫体内散在分布或聚集成团块。异，疟色素在虫体内散在分布或聚集成团块。n间日疟原虫呈短棒状，黄褐色；间日疟原虫呈短棒状，黄褐色；n恶性疟原虫呈细砂状，黑褐色；恶性疟原虫呈细砂状，黑褐色；n三日疟原虫呈砂粒状，深褐色；三日疟原虫

3、呈砂粒状，深褐色；n卵形疟原虫与间日疟原虫相似。卵形疟原虫与间日疟原虫相似。3.3.疟色素疟色素疟色素疟色素滋养体期：滋养体期：早期、晚期滋养体早期、晚期滋养体裂殖体期：裂殖体期：未成熟、成熟裂殖体未成熟、成熟裂殖体配子体期：配子体期：雌、雄配子体雌、雄配子体疟原虫在疟原虫在RBCRBC内内各期形态各期形态各不相同各不相同疟原虫在红细胞内按照生长发育繁殖的阶段不同疟原虫在红细胞内按照生长发育繁殖的阶段不同疟原虫基本结构疟原虫基本结构1.1. 红细胞通常涨大红细胞通常涨大 2.2. 薛氏点明显薛氏点明显 3.3. 环状体较粗大环状体较粗大4.4. 滋养体胞浆有阿米巴样滋养体胞浆有阿米巴样伪足伪足

4、5.5. 血片中可见各期的原虫血片中可见各期的原虫形态形态6.6. 成熟裂殖体约含成熟裂殖体约含12-2412-24个裂殖子，排列不规则个裂殖子，排列不规则 间日疟（间日疟（P. P. vivaxvivax ） 鉴定要点鉴定要点n虫体虫体约占约占RBCRBC直径的直径的1/31/3，一个一个RBCRBC含有一个原虫，含有一个原虫，偶尔偶尔2 2个个n核核红色，红色，1 1个，位于虫体个，位于虫体一侧，颇似戒指的红宝一侧，颇似戒指的红宝石。石。n胞质胞质较少，淡蓝色，呈较少，淡蓝色，呈环状，中间为大空泡。环状，中间为大空泡。1.1.早期滋养体早期滋养体-环状体环状体间日疟原虫间日疟原虫薄血膜2

5、2 间日疟原虫间日疟原虫-晚期滋养体晚期滋养体n虫体虫体由小渐大，活动显著，由小渐大，活动显著，充满充满RBCRBCn胞质胞质变形，有伪足伸出，形变形，有伪足伸出，形态不规则。有数个空泡态不规则。有数个空泡 。n核核红色，增大红色，增大n疟色素疟色素增多，呈黄褐色增多，呈黄褐色n红细胞红细胞胀大，颜色变淡，出胀大，颜色变淡，出现淡红色的现淡红色的薛氏小点。薛氏小点。 薄血膜3 3 间日疟原虫间日疟原虫-未成熟裂殖体未成熟裂殖体 n虫体虫体变圆，空泡消失变圆，空泡消失n核核开始开始分裂分裂n胞浆胞浆未分裂未分裂n疟色素疟色素黄棕色，开始集黄棕色，开始集中中薄血膜4.4.间日疟原虫间日疟原虫- -

6、成熟裂殖体成熟裂殖体大小：大小：体积大，不规则的体积大，不规则的圆形圆形裂殖子：裂殖子：数目为数目为12-2412-24不不等等, ,平均平均 1616个左右，排列个左右，排列不规则不规则核核 分裂分裂胞浆：胞浆：分裂分裂疟色素：疟色素：位于中央或一边位于中央或一边薄血膜5.1 5.1 间日疟原虫间日疟原虫-雌配子体雌配子体n虫体虫体较大，占满胀大的红细胞较大，占满胀大的红细胞n胞质胞质致密，色深蓝致密，色深蓝n核核小致密，深红色，多位于虫小致密，深红色，多位于虫体一侧体一侧n疟色素疟色素分散分散 5.2 5.2 间日疟原虫间日疟原虫-雄配子体雄配子体n虫体虫体较小，胞质蓝色而略较小，胞质蓝色

7、而略带红带红n核核大疏松，淡红色，多位大疏松，淡红色，多位于虫体的中央。于虫体的中央。n疟色素疟色素均匀散在均匀散在薄血膜1.1. 红细胞不涨大红细胞不涨大2.2. 1 1个个RBCRBC内内2 2个以上原虫个以上原虫常见，环状体内可有常见，环状体内可有2 2个核个核 3.3. 环状体可贴在红细胞环状体可贴在红细胞边缘边缘 4.4. 血片中除血片中除R R、G G外没有外没有其他发育期其他发育期5.5. 配子体呈新月形或腊配子体呈新月形或腊肠形肠形6.6. 成熟裂殖体约含成熟裂殖体约含16-3216-32个裂殖子，排列不规个裂殖子，排列不规则则7.7. 可出现茂氏点可出现茂氏点恶性疟（恶性疟（

8、P.falciparumP.falciparum） 鉴定要点鉴定要点恶性疟原虫恶性疟原虫-环状体环状体nRBCRBC不胀大不胀大n可见数粒，大小不一，红色粗大的茂氏点可见数粒，大小不一，红色粗大的茂氏点n核核1 1个，但个，但2 2个常见个常见n红细胞常含红细胞常含2 2个以上原虫个以上原虫n虫体常位于红细胞的边缘虫体常位于红细胞的边缘 ，呈，呈“鸟飞状鸟飞状”薄血膜恶性疟原虫恶性疟原虫大滋养体大滋养体 n一般不出现在外周血中一般不出现在外周血中n体小结实，圆形，不活体小结实，圆形，不活动动n疟色素集中一团，黑褐疟色素集中一团，黑褐色色n原虫此时开始集中在内原虫此时开始集中在内脏毛细血管脏毛细

9、血管薄血膜恶性疟原虫恶性疟原虫成熟裂殖体成熟裂殖体 n裂殖子裂殖子8 83636个，通常个，通常18182424个，排列不规则个，排列不规则n疟色素疟色素集中成一团集中成一团n虫体虫体占红细胞体积的占红细胞体积的2/32/3至至3/4 3/4 薄血膜 恶性疟原虫恶性疟原虫n新月形新月形，两端较尖，两端较尖n核核致密，深红色，常位于致密，深红色，常位于中央中央n疟色素疟色素黑褐色，分布于核黑褐色，分布于核周围周围n胞浆胞浆呈蓝色呈蓝色雌配子体雌配子体雄配子体雄配子体n腊肠形腊肠形，两端钝圆，两端钝圆n胞质胞质色蓝而略带红色蓝而略带红n核核疏松，淡红色，位于中央疏松，淡红色，位于中央n疟色素疟色素

10、黄棕色，小杆状，在核周围较多黄棕色，小杆状，在核周围较多 薄血膜1.1. 红细胞不涨大或略红细胞不涨大或略小小2.2. 环状体环状体中等大小，中等大小，核较大，胞浆粗厚核较大，胞浆粗厚3.3. 胞浆不活跃呈带状胞浆不活跃呈带状形形 4.4. 成熟裂殖体呈菊花成熟裂殖体呈菊花状状, ,内含内含6-126-12个裂殖个裂殖子子 5. 雌雄配子体小于雌雄配子体小于 正正 常常 红细胞，疟色红细胞，疟色 素呈深褐色素呈深褐色 6. 常可查见各阶段常可查见各阶段 的疟原虫的疟原虫三日疟（三日疟（P.malariaeP.malariae） 诊断要点诊断要点与间日疟原虫的与间日疟原虫的环状体颇相似环状体颇相

11、似三日疟原虫三日疟原虫-环状体环状体三日疟原虫三日疟原虫大滋养体大滋养体虫体虫体常呈带状常呈带状胞浆胞浆蓝色，蓝色，三日疟原虫三日疟原虫裂殖体裂殖体虫体虫体小于正常红细小于正常红细胞胞裂殖子裂殖子612个，个，排列呈菊花状排列呈菊花状疟色素疟色素呈深褐色，呈深褐色，常聚集在中央常聚集在中央虫体虫体小于正常红小于正常红细胞细胞,呈圆形呈圆形核核红，偏于一侧红，偏于一侧胞浆胞浆呈蓝色呈蓝色疟色素疟色素深褐色深褐色三日疟原虫三日疟原虫-大配子体大配子体虫体虫体小于正常小于正常红细胞红细胞三日疟原虫三日疟原虫-小配子体小配子体卵形疟（卵形疟（P. P. ovaleovale） 诊断要点诊断要点1.1.

12、 红细胞略涨大或正红细胞略涨大或正常，卵圆形或边缘常，卵圆形或边缘呈锯齿状呈锯齿状2.2. 环状体中等大小，环状体中等大小，核较大，胞浆粗厚核较大，胞浆粗厚3.3. 薛氏点出现较早粗薛氏点出现较早粗大，量多大，量多4.4. 成熟裂殖体约含成熟裂殖体约含6-6-1212个裂殖子个裂殖子 5. 5. 常可查见各阶段的常可查见各阶段的 疟原虫疟原虫 环状体环状体滋养体滋养体裂殖体裂殖体 配子体配子体卵形疟 被寄生的红细胞被寄生的红细胞 间日疟原虫间日疟原虫 大小大小 斑点斑点胀大胀大 滋养体期开始滋养体期开始出现薛氏点出现薛氏点( (Schuffners dots )，出现，出现稍晚，鲜红色，稍晚，

13、鲜红色，细小数多细小数多 恶性疟原虫恶性疟原虫正常或略缩小正常或略缩小 常见有茂氏点常见有茂氏点(Maurers dots) ，紫褐，紫褐色，粗大数少色，粗大数少 三日疟原虫三日疟原虫正常或缩小正常或缩小 常见有齐氏点常见有齐氏点(Ziemanns dots )，淡红，淡红色，微细色，微细卵形疟原虫卵形疟原虫略大或正常略大或正常感染红细胞感染红细胞边缘呈距齿边缘呈距齿状状常见有薛氏常见有薛氏点点,出现较早，出现较早，环状体阶段环状体阶段可见，可见，红色，微粗红色，微粗疟原虫基本结构疟原虫基本结构 寄生的红细胞寄生的红细胞: : 经染色后，因细胞内血红蛋经染色后，因细胞内血红蛋白溶解，轮廓消失，

14、但有时尚留下残骸的白溶解，轮廓消失，但有时尚留下残骸的“影影子子”或点彩。或点彩。 厚血膜由于用血量多，血膜小，细胞重迭，厚血膜由于用血量多，血膜小，细胞重迭，干燥缓慢，各期疟原虫的体积都略为缩小，其干燥缓慢，各期疟原虫的体积都略为缩小，其中大、小滋养体的形态有较大改变，裂殖体和中大、小滋养体的形态有较大改变，裂殖体和配子体的形态则变化不大。配子体的形态则变化不大。厚血膜中疟原虫的形态厚血膜中疟原虫的形态：厚血膜间日疟原虫间日疟原虫 厚血膜厚血膜环状体环状体配子体配子体滋养体滋养体裂殖体裂殖体恶性疟原虫恶性疟原虫厚血膜RingsGametocytesPM 三日疟原虫三日疟原虫厚血膜配子体配子体

15、滋养体滋养体裂殖体裂殖体恶恶性性疟疟环环状状体体滋滋养养体体裂裂殖殖体体配配子子体体间间日疟日疟三三日日疟疟卵卵形形疟疟 由于在血膜制备过程中由于在血膜制备过程中红细胞溶解，红细胞溶解，因而其因而其原形态消失原形态消失，且染液和玻片上可能存在，且染液和玻片上可能存在杂质杂质等，等，要根据疟原虫的三个基本要素仔细要根据疟原虫的三个基本要素仔细加以鉴别。加以鉴别。n（1)1)疑似疟色素疑似疟色素 厚血膜在制作和染色过程厚血膜在制作和染色过程中，血膜上的染料残渣及空气中或耳垂上的中，血膜上的染料残渣及空气中或耳垂上的尘埃，有时可误认为疟色素。尘埃，有时可误认为疟色素。疟原虫与其他异物的鉴别疟原虫与其

16、他异物的鉴别n（2 2）疑似疟原虫核）疑似疟原虫核n细菌尤其是球菌或白细细菌尤其是球菌或白细胞碎裂后散出的颗粒，胞碎裂后散出的颗粒，常染成红色小点，常与常染成红色小点，常与疟原虫的核相似。疟原虫的核相似。n（3 3）疑似疟原虫胞浆）疑似疟原虫胞浆 n网织红细胞的残骸和白细胞的残骸，常被染网织红细胞的残骸和白细胞的残骸，常被染成蓝色，颇似疟原虫的胞浆，有时因与上述红成蓝色，颇似疟原虫的胞浆，有时因与上述红点巧合一起，而容易误认为疟原虫的大滋体，点巧合一起，而容易误认为疟原虫的大滋体，可依据疟色素的特点加以区别可依据疟色素的特点加以区别疟原虫与其他异物的鉴别疟原虫与其他异物的鉴别薄血膜中常见的血液

17、成分薄血膜中常见的血液成分血小板中性粒细胞中性粒细胞单核细胞单核细胞淋巴细胞淋巴细胞嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞（4）血液成份与分析）血液成份与分析（5 5）杂质）杂质-类似疟原虫的物质类似疟原虫的物质疟原虫与其他异物的鉴别疟原虫与其他异物的鉴别（6 6） 形态失常形态失常l疟原虫成份丢失。疟原虫成份丢失。l成份增加。成份增加。如在多虫感染、多核以及如在多虫感染、多核以及多虫重叠时疟原虫形态构造会有异于多虫重叠时疟原虫形态构造会有异于正常。正常。l形态改变。形态改变。恶性疟粗大的环状体。恶性疟粗大的环状体。l 药物影响。药物影响。 服服氯喹氯喹后后, ,大滋养体胞浆停滞发育，失去阿大滋养体胞浆停滞

18、发育，失去阿米巴样形态，并发生碎解和色泽加深米巴样形态，并发生碎解和色泽加深. . 服服伯喹伯喹后后, ,配子体的核和胞浆破碎，疟色素配子体的核和胞浆破碎，疟色素粗大并相对集中等。粗大并相对集中等。 血片的制作与染色血片的制作与染色 n血液涂片镜检疟原虫目前仍是确血液涂片镜检疟原虫目前仍是确诊疟疾和鉴别虫种的主要方法，诊疟疾和鉴别虫种的主要方法，玻片清洁与否玻片清洁与否，血片制作的质量血片制作的质量和染色的好坏，和染色的好坏，直接影响镜检的直接影响镜检的速度和准确性。速度和准确性。血片制作血片制作所需材料所需材料: 载玻片载玻片 采血针采血针 75酒精棉球酒精棉球 玻片盒玻片盒n载玻片的清洗：

19、载玻片的清洗：n新玻片的清洗方法新玻片的清洗方法 用加有洗洁精或洗用加有洗洁精或洗衣粉的热水洗涤，浸于衣粉的热水洗涤，浸于95% 95% 的乙醇中的乙醇中1 1小时以上小时以上n已用过的玻片：已用过的玻片：用加有洗衣粉的热水洗用加有洗衣粉的热水洗涤，浸于涤，浸于95% 95% 的乙醇中的乙醇中1 1小时以上小时以上 载玻片载玻片取血部位取血部位: 指尖指尖 耳垂耳垂血片制作血片制作标准的推片姿势标准的推片姿势薄血膜的涂制：薄血膜的涂制：取血液取血液1-1.5l1-1.5l血滴置于载玻片的血滴置于载玻片的中央中央，将推片的一端置于血滴之前，当血液在载玻将推片的一端置于血滴之前，当血液在载玻片与推

20、片之间向两侧扩展至片与推片之间向两侧扩展至约约2cm2cm宽宽时，两时，两玻片保持玻片保持20-3020-30角，角，推成舌状薄血膜，推成舌状薄血膜，长约长约2-2.5CM2-2.5CM。血片制作血片制作 血片制作血片制作 厚血膜的涂制：厚血膜的涂制： 取血液取血液4-5l4-5l 血滴置于载片的中央偏血滴置于载片的中央偏右右1/31/3， 由里向外划圈涂成直径为由里向外划圈涂成直径为0.8-10.8-1厘米厘米 厚薄均匀、圆形厚血膜厚薄均匀、圆形厚血膜. .血片制作血片制作 每张载玻片上分别做每张载玻片上分别做1 1个薄血膜，个薄血膜，1 1个厚血个厚血膜。标准血膜的位置如下图所示。膜。标准

21、血膜的位置如下图所示。血片制作血片制作厚、薄血膜优缺点厚、薄血膜优缺点 厚血膜厚血膜 薄血膜薄血膜 优点优点血量多，面积小，血量多，面积小，原虫检原虫检出率高出率高红细胞完整，原虫形红细胞完整，原虫形态改变不大，态改变不大，原虫易原虫易于辨认于辨认 缺点缺点原虫在干燥过程中皱缩，原虫在干燥过程中皱缩，红细胞消失，原虫变形较红细胞消失，原虫变形较大，大，原虫鉴定困难原虫鉴定困难血量比厚血膜少许多，血量比厚血膜少许多，面积比厚血膜的大。面积比厚血膜的大。检查费时，检查费时，原虫检出原虫检出率较低率较低 用途用途用于疟疾病人检查用于疟疾病人检查原虫虫种、虫期鉴定原虫虫种、虫期鉴定及初学者教学标本及初

22、学者教学标本血片染色血片染色两种染色方法两种染色方法: :n吉氏染色法吉氏染色法n瑞氏染色法瑞氏染色法n常用吉氏染色法常用吉氏染色法血片的染色血片的染色n待血片待血片完全干燥完全干燥后才可染色后才可染色n1 1血膜的固定血膜的固定-甲醇甲醇 吉氏染液：染色方法吉氏染液：染色方法薄血膜经甲醇固定干燥后，薄血膜经甲醇固定干燥后，将血片平放，将血片平放，用用PH7.0-7.2PH7.0-7.2的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液或蒸馏水将吉氏原液稀释，或蒸馏水将吉氏原液稀释，原液与缓冲液为原液与缓冲液为1:201:20。混混匀匀染色染色20-3020-30分钟分钟，晾干镜检。晾干镜检。厚血膜溶血染色厚血膜溶血染

23、色 放置多时未染色的血片（放置多时未染色的血片（2 2天以上，薄天以上，薄片已用甲醇固定），在染色之前，须在片已用甲醇固定），在染色之前，须在厚血膜上用清水进行溶血，待血膜全部厚血膜上用清水进行溶血，待血膜全部溶解后倒掉，用吉氏染液染色溶解后倒掉，用吉氏染液染色, ,清水漂清水漂洗干净洗干净, ,晾干。晾干。n 染色用水和冲洗用水染色用水和冲洗用水npH7.0pH7.0pH7.2pH7.2缓冲蒸馏水效果最佳缓冲蒸馏水效果最佳。n先制备好两种贮备液先制备好两种贮备液n贮备液贮备液I 1/15MI 1/15M磷酸氢二钠（磷酸氢二钠（NaNa2 2HPOHPO4 4）溶液溶液 n NaNa2 2HP

24、OHPO4 4 9.5 g9.5 gn 蒸馏水蒸馏水 1000 ml1000 mln贮备液贮备液 1/15M 1/15M磷酸二氢钾磷酸二氢钾 （KHKH2 2POPO4 4 ）溶液溶液 n KHKH2 2POPO4 4 9.07 g 9.07 gn 蒸馏水蒸馏水 1000 ml1000 mln缓冲蒸馏水配制缓冲蒸馏水配制nPH M/15 NaPH M/15 Na2 2HPOHPO4 4 M/15 KH M/15 KH2 2POPO4 4 DW DW n (ml) ( ml) (ml)n7.0 63 37 900n7.1 68 32 900n7.2 73 27 900n缓冲蒸馏水宜用时缓冲蒸馏水

25、宜用时新鲜配制新鲜配制为好。为好。n着色较好的血片，着色较好的血片，肉眼看上去肉眼看上去呈淡紫呈淡紫红色红色，不应该出现蓝不应该出现蓝绿色或红色；绿色或红色；镜检红细胞呈镜检红细胞呈淡红色淡红色，嗜酸性细胞的，嗜酸性细胞的颗粒呈颗粒呈鲜红色鲜红色，淋巴细胞及疟原虫的，淋巴细胞及疟原虫的胞浆呈胞浆呈蓝色或淡蓝色蓝色或淡蓝色，白细胞的核呈，白细胞的核呈紫蓝色紫蓝色，疟原虫的核呈，疟原虫的核呈红色红色，疟色素，疟色素清晰可见，在显微镜下仅有小量染液清晰可见，在显微镜下仅有小量染液沉淀。沉淀。 血片制作注意事项血片制作注意事项（1 1）在制作血片前，首先要核对患者的）在制作血片前，首先要核对患者的 姓

26、名、年龄和住址姓名、年龄和住址（2 2）载玻片必须清洁无油污，理想的薄）载玻片必须清洁无油污，理想的薄 血膜是一层血细胞均匀分布不重血膜是一层血细胞均匀分布不重 叠、无裂缝、无皱折和空泡，血膜叠、无裂缝、无皱折和空泡，血膜 末端呈舌状。末端呈舌状。（3 3）厚血膜厚度以一个油镜视野内可见厚血膜厚度以一个油镜视野内可见5-5-1010个白细胞为宜。个白细胞为宜。（4 4）制成的血片在未干前不能倾斜放置，制成的血片在未干前不能倾斜放置，待其自然干燥，不要加热，加热会使原虫待其自然干燥，不要加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果变形，影响镜检结果血片制作注意事项血片制作注意事项（1 1）染料溶剂的质量）染料溶剂的质量 （2）染液的新旧）染液的新旧（3）染液稀释后使用时间）染液稀释后使用时间原液必须临用时稀释，随配随用。原液必须临用时稀释，随配随用。（4）染液的稀释浓度）染液的稀释浓度（5）染色时间）染色时间 (6) 染色稀释用水染色稀释用水:Ph7.0-7.2 染色质量影响因素染色质量影响因素n（7 7）血膜在制备后应尽量能在当天染色，）血膜在制备后应尽量能在当天染色