生化分析试题

1、1、简述盐析的定义、原理及应用定义：增加中性盐浓度使蛋白质、气体、未带电分子溶解度降低的现象。是蛋白质分离纯化中经常使用的方法，最常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等。原理：加入某种电解质盐析剂, 这种加入的盐析剂，其离子的水合作用比原溶液中其它盐较强, 它使溶液中自由水分子数减小, 从而提高溶液中欲结晶物质在溶液中的有效浓度，使欲结晶物质在溶液中结晶析出。应用：胶体凝聚如豆腐的制作，乙酸乙酯等的提纯萃取及浓缩，生物大分析试样的粗制2、简述透析的基本操作、注意事项及应用基本操作：将待分离或纯化样品封入由半透膜组成的透析袋里，然后将袋子放入低离子强度的透析液中，此时袋内分子量小于透析袋截留分子

2、量的分子可通过膜进入透析液，从而实现大分子与小分子物质的分离。注意事项：透析过程实现平衡大约需要46 h因此通常应在4°C左右进行，并需进行搅拌，勤换透析液或采用较大量透析液可加速该过程。应用：大分子样品中去除盐类及其它小分子（如有机溶剂等）；去除与大分子结合较弱的小分子或离子（透析液中加入适量螯合剂可加快该过程）；利用透析平衡可以测定大分子（蛋白质或核酸）与小分子间的结合常数。试样浓缩：可直接用吸收剂（聚乙二醇）吸收3、简述速率区带离心法与等密度离心法的操作及应用速率区带离心法：离心前在离心管内先装入密度梯度介质，将待分离样品轻轻铺在密度梯度介质的液面上，与其一起离心。由于待分离的

3、粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。该方法属不完全沉降。离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有分离。受沉降受物质本身大小影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。 等密度离心法：与速率区带离心法类似，区别在于所使用的密度梯度介质的配制，该法中的密度梯度区间必须包含被分离样品中所有粒子的密度。在足够转速及时间的条件下，粒子稳定地处于梯度介质中密度与其相等区域，从而实现分离。粒子形成纯组分的区带，与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心

4、时间也不能改变这些粒子的成带位置。 4、简述电泳的基本原理及影响因素电泳的基本原理：生物大分子如蛋白质,核酸,多糖等大多都有阳离子和阴离子基团,称为两性离子.常以颗粒分散在溶液中,它们的静电荷取决于介质的H+浓度或与其他大分子的相互作用.在电场中,带电颗粒向阴极或阳极迁移,迁移的方向取决于它们带电的符号,这种迁移现象即所谓电泳. 影响因素：电泳介质的pH值，缓冲液的离子强度，电场强度，电渗现象。5、简述聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理原理：SDS（十二烷基磺酸钠）可破环蛋白的高级结构（变性），并按1.4：1（w/w）的固定比例与变性后的蛋白结合，而且SDS携带的大量负电荷完全将蛋白自身

5、电荷屏蔽，复合物均带负电荷，此时复合物的迁移速率不再决定于蛋白质的荷电性质，而完全决定于蛋白质的分子量（体积）。体积越大，移动的阻力越大，反之越小（与凝胶排阻层析不同，凝胶电泳无外水体积），分子量的对数与电泳迁移率成线形关系（已知分子量的标准蛋白做标准曲线）6、简述空间排阻色谱与凝胶电泳的区别空间排阻色谱存在外水相7、简述生物试样的保存的注意事项低温保存、一定的保存期限、尽量以干粉形式保存8、写出具有紫外吸收的常见氨基酸的名称及结构式苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸9、何为蛋白质的一级、二级、三级、四级结构蛋白质的一级结构：包括组成蛋白质的多肽链数目，多肽链的氨基酸顺序以及多肽链内或链间二硫键的数目和

6、位置。蛋白质的二级结构：指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链原子的相对空间位置，但并不涉及氨基酸残基侧链的构象。蛋白质的三级结构：指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，即肽链中所有原子在三维空间的排布位置，三维构象从根本上还是决定于一级结构。蛋白质的四级结构：蛋白质中不同种类和数目的亚基在空间的排布及亚基之间接触部位的布局和相互作用。10、何为蛋白质变性，简述能引发蛋白质变性的因素天然蛋白质分子在外界因素的作用下，由紧密有序的结构变成松散无序的结构，并使得蛋白质的物理（溶解度、旋光性、吸收光谱）、化学性质（水解速度、反应能力等）及生物活性（如酶的活性等）发生变化的现象称为

7、变性。变性只涉及次级键和二硫键的断裂，一般不涉及一级结构的变化。因素包括：热变性：50-60°C以上，多为凝聚和沉淀的不可逆变性酸碱变性：pH410（等电点附近）稳定尿素和盐酸胍：浓度6 mol×L-1时，二、三、四结构完全丧失，甚至发生凝聚和沉淀现象表面活性剂其它因素：有机试剂、盐、超声波11. 简述凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理答：样品与硫酸一同加热消化, 分解有机质, 释放出的NH3 与硫酸结合成硫酸铵留在溶液中。在定氮消化瓶中,用氢氧化钠中和硫酸铵生成氢氧化铵,加热又分解NH3 ,用硼酸吸收, 用标定过的盐酸或硫酸滴定, 从而计算出总氮量, 换算为蛋白质量。12.

8、除凯氏定氮法外还有哪些可测定蛋白质总量的方法，简单评述其优劣答：（1）紫外光谱法：方便，快速，但存在核酸干扰 （2）荧光光谱法：如荧光探针法，荧光光谱法灵敏度高，复杂组分辨识度好，但检测蛋白质的范围受到较大的限制。（3）显色法： 双缩脲法：不同蛋白质差异小，但灵敏度低 Lowry法：灵敏度高，但是费时费力，且干扰大 （4）显色法-染料结合法 甲基橙法：与白蛋白结合强，络合物在550nm光吸收减小，但存在蛋白质间差异 考马氏亮蓝法：结合后595nm光吸收增强，高灵敏、低干扰、但存在蛋白质间差异 溴甲酚绿和溴甲酚紫法：可对白蛋白进行快速的分析，但因它们会与非蛋白类蛋白质物质结合而受到非特异性干扰。

9、13. 简单描述测定蛋白质一级结构的基本步骤 答：测定蛋白分子中多肽链数目 拆分蛋白质的多肽链并分离 测定多肽链的氨基酸组成 分析多肽链的N末端和C末端 断裂二肽链中的二硫键 多肽链断裂成肽段 测定各个肽段的氨基酸序列 确定各肽段在多肽中的顺序 确定原多肽链中二硫键位置14. 结合酶各部分在催化反应中的作用如何· 答：酶蛋白决定反应的特异性· 辅助因子决定反应的种类与性质 金属离子的作用：稳定酶构象；参与催化反应，传递电子；在酶蛋白与底物之间起桥梁作用，中和阴离子，降低反应中的静电斥力等 小分子有机化合物的作用：在反应中起运载体的作用，传递电子、质子或其它基团15. 何为酶

10、的活性中心，它包含哪些必须基团答：（1）活性中心内的必需基团 结合基团（binding group）：与底物结合 催化基团（catalytic group）：催化底物转变为产物（2）活性中心外的必需基团位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。16、如何测定酶的米氏常数，其意义何在1、双倒数作图法：将速率方程重排得到，将对作图，从直线斜率可得到，从直线的截距得到，二者联立求得。2、Hanes作图法：，原理同双倒数作图法意义：简而言之，酶的特性常数之一，可近似表示酶对底物的亲和力，同一酶对不同底物有不同的km值17、温度及pH对酶催化活性的影响趋势如何？如何解释该现象？温度：双重影响

11、，温度升高，酶促反应速率升高；但又会引起酶变性，导致反应速率降低。解释：低温下，温度升高，酶活性也升高，当升高到一定值时，酶的活性达到最大值，此时的稳定为topt(最适宜温度)，当温度继续升高，酶的活性又降低。pH：pH值对不同的酶存在不同的影响，如胃蛋白酶在pH =1左右活性最高，pH增大会使其活性降低；而对于胆碱酯酶在酸性条件下几乎没有活性，当pH升至810时，活性达到最大的水平，如图所示：18、有机磷化合物引发人体中毒的机理是什么抑制了乙酰胆碱酯酶的活性，造成组织中乙酰胆碱的积聚，引起胆碱能受体活性紊乱，而使有胆碱能受体的器官功能发生障碍。19、磺胺类药物的抑菌机理是什么竞争性抑制机理：

12、磺胺药的化学结构与对氨苯甲酸类似，能与对氨苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶，影响了二氢叶酸的合成，因而使细菌生长和繁殖受到抑制。20、竞争性与非竞争性抑制各具什么特点？配合图示说明竞争性抑制特点：1、I（抑制剂）与S（底物）结构类似，竞争酶的活性中心2、抑制程度取决于抑制剂与酶相对亲和力及底物浓度3、动力学特点：vmax不变，表观km增大非竞争性抑制剂特点：1、 抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系2、 抑制程度取决于抑制剂的浓度3、 动力学特点：vmax降低，表观km不变21 何谓酶活性？通常采用什么方法测定？一般采用什么单位？ 酶的活性：酶催化化学反应的能力，测定方法：终

13、止法，连续法，酶偶联法；一般采用的单位：催量单位（katal）：在特定的条件下，每秒钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量为1 katal（=6´107 U）国际单位（U）：在特定的条件下，每分钟催化1 mmol底物转化为产物所需的酶量为1 U比活性：单位质量（mg）或体积（ml）的酶蛋白所具有的催化活性（U/mg或U/ml ） 22 简述酶联法测定葡萄糖的原理 23 抗原具有的两个基本性质是什么 免疫原性（immunogenicity）：指能引起免疫应答的性能，即能够刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞 免疫反应性（immunoreactivity）:又称抗原特异性（antigen sp

14、ecificity）或抗原专一性，指能与免疫应答物：抗体或致敏淋巴细胞在体内外相互作用起反应的性能。 24 影响抗原性的因素有哪些 1抗原的种类：天然抗原多为大分子有机物，多数蛋白质为良好的抗原，多糖及多肽也具一定的免疫原性，其化学性质有关。 2分子大小：抗原的分子量一般>10 kD，且分子量越大，免疫原性越强，其机制为： 表面分布较多抗原决定基； 化学性质相对稳定； 降解及排除速率较慢，有利于持续刺激机体免疫系统 3化学组成及物理性状： 分子量并非决定免疫原性的惟一和绝对因素，免疫原性物质还须具备复杂的化学组成与特殊的化学基团。例如：简单重复的有机大分子不具免疫原性（如磺化聚苯乙烯）；

15、明胶的分子量逾100 kD，但其仅由直链氨基酸组成，故免疫原性很弱；胰岛素分子量仅5.7 kD，但其序列中含芳香族氨基酸，故具免疫原性。 颗粒抗原的免疫原性强于可溶性抗原；多聚体的免疫原性强于单体。 4抗原决定基的易接近性（accessibility）：即抗原决定基是否易被淋巴细胞的抗原受体所接近 25 何为半抗原？如何将其转变为全抗原 半抗原：具有一定结构特征的小分子，它自身不具备免疫原性，但可与大分子载体偶联形成完全抗原，引发免疫应答得到能与该半抗原抗体。26.何为抗体？简述其基本结构特征抗体是介导体液免疫的重要效应分子，是B细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的可特异性结合抗原的糖蛋

16、白，是具有免疫性质的球蛋白。典型的免疫球蛋白分子基本结构呈“Y”字型，亦称基本四肽单位或Ig单体，由两条相同的重链和两条相同的轻链通过二硫键连接而成。重链和轻链近氨基端的1/4或1/2氨基酸序列变化很大，为可变区；其它部分氨基酸序列相对恒定，为恒定区；位于CH1和CH2之间富含脯氨酸的区域为铰链区。27.简单描述抗体产生的动力学过程初次应答：初次用抗原免疫动物，动物需经一定的潜伏期才能产出低效价的以IgM为主的抗体。二次应答：再次用相同的抗原对动物进行免疫，潜伏期明显缩短，效价增高，而且维持时间长，此时产生的抗体以IgG为主。这就是抗体产生的动力学过程。28.何为克隆选择，其基本特征是什么，实

17、质是什么淋巴细胞不需要抗原的作用，就已分化为多种带有不同抗体的细胞。一种抗原侵入人体后，在无数种淋巴细胞中，只有表面本来就带有和这种抗原互补的受体的少数淋巴细胞能和抗原结合。一经结合，这种淋巴细胞就恢复了分裂的能力，连续分裂产生大量带有同样抗体的淋巴细胞群。这一群细胞由于是同一来源的，所以称为克隆。这就是克隆选择。特征：1.动物体内存在着许多免疫活性细胞克隆，不同克隆的细胞具有不同的表面受体，能与相对应的抗原决定簇发生互补结合。2.一旦某种抗原进入体内与相应克隆的受体发生结合后便选择性地激活了这一克隆（结合力高于某个定值），3.使它扩增并产生大量抗体（即免疫球蛋白）。4.抗体分子的特异性与被选

18、择的细胞的表面受体相同。实质：带有各种受体的免疫活性细胞克隆早已存在，抗原的作用只是选择并激活相应的克隆；细胞受体和该细胞后代所分泌的产物（抗体）具有相同的特异性。29.何为单克隆抗体，简述其制备过程单克隆抗体是高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的B细胞克隆所分泌。一般来自杂交瘤细胞。制备过程：用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生免疫脾细胞；再将该细胞与已培养好的骨髓瘤细胞在聚乙二醇的作用下融合成杂交瘤细胞；然后采用HAT选择性培养基培养，未融合的细胞死亡，杂交瘤细胞则存活；再进行阳性克隆的筛选与克隆化，通常采用有限稀释法；最后进行克隆扩增，大量制备单克隆抗体。30简述酶联免疫法的基本原

19、理标记免疫分析法原理：依靠在分析体系中引入探针（放射性同位素、荧光分子、化学和生物发光系统、酶及其底物）来实现高灵敏检测，以了解反应是否发生，发生部位，以及发生的程度（即对未知成分的样品进行定性、定位及定量分析）。分析法：测定之前需要进行固-液分离（属于多相分析，均相分析较少），虽然标记探针不同，但基本原理大致相同。其中以酶联免疫吸附分析（ELISA）应用最为广泛。31 欲采用ELISA法测定一小分子物质（符合半抗原条件），请设计出基本的操作步骤（提供所有必需基本原料，抗体除外）酶联免疫法检测食品中盐酸克伦特罗一多克隆技术获得抗体盐酸克伦特罗的相对分子质量仅为313，具有免疫原性，却不具有抗原

20、性，必须与大分子载体蛋白交联才能刺激动物产生特异性免疫应答。本方法采用重氮化法，将盐酸克伦特罗与BSA交联，合成完全抗原作为免疫原免疫BALB/c小鼠，获得抗体。具体步骤如下：盐酸克伦特罗的偶氮化取盐酸克伦特罗100mg，加入6ml预冷的1mol/L盐酸，在冰水浴中搅拌，缓慢滴加亚1Mol/L硝酸钠溶液。期间用淀粉碘化钾试纸检验，直至试纸变为深蓝色为止。搅拌30min盐酸克伦特罗与BSA交联使用分析天平准确称取0.6gBSA，溶于包被缓冲液中（pH=9.5）。将偶氮化的盐酸克伦特罗缓慢滴入BSA中，（4.5mgBSA或OVA溶于0.5ml 0.1mol/LL磷酸盐缓冲溶液中，ph=8）。滴加过

21、程不断用氢氧化钠溶液调节ph恒定，两部分液体必须冰水浴，温度必须低于4摄氏度。将反应所得橙色反应液置于4摄氏度下搅拌过夜。盐酸克伦特罗与OVA偶联：实验步骤同步骤2.使用紫外分光光度法，鉴定偶联是否成功。配置适当浓度的CL溶液（0.25mg/mL）和载体蛋白溶液（0.5mg/mL）,使其扫描的吸光度值在0.51.5之间，分别对CL及载体蛋白，偶联物进行紫外扫描，根据光路叠加原理，可以假设偶联物的吸光系数为CL及载体蛋白的吸光系数之和，根据同浓度的偶联物与蛋白质吸光度的差别以及盐酸克伦特罗的吸光系数，可以计算得偶联物的产率。小鼠免疫：使用68周龄的雌性Balb/c小鼠，共5只。取BSA-CL12

22、uL，加入188uLPBS稀释后，完全弗式佐剂与等体积的，于小鼠皮下多点注射免疫小鼠。2周后使用半完全弗式佐剂乳化，再次免疫；4周后，使用半完全弗式佐剂乳化再次免疫。第44天，脱颈处死小鼠，去毛，消毒，取血液，冰冻保存。1将存放于三角烧瓶中的血置于37摄氏度的恒温箱中1h，在置于34摄氏度的冰箱中34小时，待血液凝固血块收缩后，用毛洗滴管吸取血清，于3000rpm离心15分钟，取上清做免疫检测用，冷冻保存备用。将采集的抗血清加入等体积的生理盐水混匀，然后逐dd加饱和硫酸铵，边加边搅拌，防止沉淀出现，使硫酸铵饱和度达50%，混匀后静置4摄氏度冰箱过夜，第二天离心分离，弃去上清，取沉淀物溶于少量生

23、理盐水中，用饱和硫酸铵沉淀，离心，收集沉淀，溶解与ph=7.4的磷缓中。将提取物装入透析袋，在生理盐水中透析，离心，的上清液，就是粗提的免疫球蛋白啦二效价评定效价评定有几种方法。刘老师给的是用可产生沉淀的最稀抗血清浓度来衡量的。但是小弟只查到能产生紫外吸收的最稀抗血清浓度来衡量的1. 包被：用0.05Mph=9.6的碳酸盐缓冲溶液，在聚苯乙烯板孔中分别假如等浓度梯度稀释的OVA-CL与阴性血清0.1mL，37摄氏度孵育两小时。弃去版中溶液，洗涤3次，每次皆用吸水纸吸去版中洗涤液。封闭：每孔加200ulL封闭液（0.05%0.5%OVA），37摄氏度孵育50min，洗涤3次。测定：加酶标抗体与底

24、物，测吸光度，以空白孔调零，抗血清的吸光度为阴性吸光度2倍时为阳性。三.盐酸克伦特罗的测定原理：基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定。微孔板包被有针对盐酸克伦特罗IgG的抗体。盐酸克伦特罗抗体被加入，经过孵育及洗涤步骤后，加入竞争性酶标记物（就是连有过氧化物酶的，能和抗体结合的某物质）、标准溶液或试样溶液。盐酸克伦特罗与竞争性酶标记物竞争盐酸克伦特罗抗体，没有与抗体连接的盐酸克伦特罗标记酶在洗涤步骤中被除去，将底物（过氧化尿素）和发色剂（四甲基联苯胺）加入孔中孵育，结合的标记酶将将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应液后使颜色由蓝色转变为黄色。在450nm处测量吸光度值。吸光度值与盐酸克伦特罗

25、的浓度的自然对数成反比。仪器与设备：超声波清洗器；磨口玻璃离心管；酸度计；离心机震荡器；旋转蒸发器；涡旋式混合器；匀浆机；酶标仪；微量移液器。主要试剂：0.1mol/L高氯酸溶液；1mol/L氢氧化钠溶液；0.1mol/L磷酸二氢钠缓冲液；异丙醇-乙酸乙酯（40：60）溶液；针筒式微孔滤膜（0.45um，水相）；盐酸克伦特罗酶联免疫试剂盒（市场有售）；盐酸克伦特罗标准系列（至少5个倍比稀释浓度，外加一个空白）；过氧化物酶标记物（据说市场有售个人觉得，可能也是用重氮盐偶联法，将盐酸克伦特罗和酶偶联一起的）；盐酸克伦特罗抗体；酶底物（过氧化尿素）；反应终止液（1mol/L硫酸）；发色剂，四甲基联苯

26、胺；缓冲液（0.1mol/L磷酸二氢钠缓冲液）。操作步骤：提取：不同试样有不同的消解与提取方法哦试剂及试样制备：竞争性酶标记物：市场上的竞争性酶联标记物为浓缩液，由于稀释的酶标记物稳定性不好，用时近稀释试剂需要用量的酶标记物。在吸取浓缩液之前，要仔细震荡，用缓冲液以1：10的比例稀释酶标记物浓缩液。盐酸克伦特罗抗体：市场上的盐酸克伦特罗抗体浓缩液，由于稀释的抗体稳定性不好，用时近稀释试剂需要用量的抗体。在吸取浓缩液之前，要仔细震荡，用缓冲液以1：10的比例稀释酶标记物浓缩液。包被：用0.05Mph=9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释，在聚苯乙烯板孔中加入经过稀释的抗阴性血清0.1mL，37摄氏度孵育两

27、小时。弃去版中溶液，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每行拍打3次），以保证完全除去孔中液体。用250ul蒸馏水充入孔中，再次倒掉微孔中液体，重复操作2遍以上，记录加样位置。试样制备：取20ul的样品提取物进行分析，高残留的样品用蒸馏水进一步稀释后分析3 测定 A将标准液和试样所用数量的孔条插入微孔架，记录标准品和试样位置B加入100uL的稀释后的抗体溶液到每一个微孔中，充分混合并在室温下孵育15minC倒出孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每行拍打3次），以保证完全除去孔中液体。用250ul蒸馏水充入孔中，再次倒掉微孔中液体，重复操作2遍以上 D分别加入20ul的标准样或、及处理好的试样到各自

28、的为微孔中，标准样和试样至少做两个平行实验。E加入100ul稀释的酶标记物，室温孵育30minF重复C步骤G加入50ul酶底物（过氧化尿素）和50ul发色试剂（四甲基联苯胺）至微孔中，充分混合并在室温处孵育15minH假如100ul反应停止液至微孔中，混合好后尽快在450nm波长处测量吸光度值。（有专门ELISA测吸光度的仪器的好像是什么酶联免疫检测仪）32 写出DNA中含有的碱基名称、结构与它们的配对关系 配对关系：AT CG33何为DNA分子的变性与复性DNA的变性（denaturation）定义：某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、酰胺及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等变性后其它理化性质变化A260增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲线改变；生物活性丧失DNA分子的复性（ren