生物医学光子学_scy-3_共聚焦激光扫描(荧光)显微镜20151125

1、共聚焦显微技术共聚焦显微技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术人眼分辨率：人眼分辨率：0.2mm光学显微镜分辨率：光学显微镜分辨率：0.25m25mm共焦显微镜分辨率：共焦显微镜分辨率：0.18m mm电子显微镜分辨率：电子显微镜分辨率：0.2nm共聚焦激光扫描（荧光）显微镜共聚焦激光扫描（荧光）显微镜 激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。激光共聚焦显微镜利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置，

2、以及通过针孔的选择和PMT的收集，并带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。与传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点。所以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。 ObjectiveArc LampEmission FilterExcitation DiaphragmOcularExcitation FilterObjectiveLaserEmission PinholeExcitation PinholePMTEmissionFilterExcitation FilterConfocal PrincipleConfo

3、cal Principle照明针孔照明针孔探测针孔探测针孔二色镜或分光镜二色镜或分光镜激光光源激光光源共聚焦显微镜的优点减少由于光散射产生的图像模糊增加有效分辨率提高信噪比厚标本的清楚细查Z轴扫描可以实现数字放大倍率的调节激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的共焦显微镜与传统显微镜的区别区别1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像抑制图像的模糊，获得清晰的图像激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的共焦显微镜与传统显微镜的区别区别2. 具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片conventional

4、confocal激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的共焦显微镜与传统显微镜的区别区别3. 增加侧向分辨率增加侧向分辨率d2alconventionconfocaldd激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的共焦显微镜与传统显微镜的区别区别4. 由于点对点扫描去除了杂散光的影响由于点对点扫描去除了杂散光的影响激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术三三. 激光扫描共焦显微镜的设计特点激光扫描共焦显微镜的设计特点:1.点照明点照明2.具有照明具有照明pinhole和探测和探测pinhole3.照明照明pinhole和探测和探测pinh

5、ole共轭共轭(共焦共焦), 共焦点共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面4.具有扫描系统具有扫描系统 逐点扫描成像逐点扫描成像 5.具有多个（四个）具有多个（四个） 荧光通道，可同时探测多个荧光通道，可同时探测多个被标记物被标记物 激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术技术指标（技术指标（Leica TCS SP2) : 1. xy分辨率比传统显微镜小分辨率比传统显微镜小1.4x 传统显微镜传统显微镜: Rxy=0.61 /NA （0.25 m mm ) Confocal: Rxy=0.4 /NA（0.18 m mm )2. 样品的最大厚

6、度样品的最大厚度: 取决于取决于: 物镜的物镜的NA、物镜的工作距离、物镜的工作距离 激光的穿透力、样品的透明度激光的穿透力、样品的透明度 Z轴的最大移动范围轴的最大移动范围(166m mm、Z-wide)3. 样品的最小光切厚度样品的最小光切厚度: (载物台最小移动距离为载物台最小移动距离为40nm） 取决于取决于: 物镜的物镜的NA、针孔大小、针孔大小 Z轴的最小移动步距轴的最小移动步距: 40nm Z轴的分辨率轴的分辨率: 0.35 m mm 激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术4. 激光器激光器 Ar激光器激光器: 458nm, 476nm, 488nm, 514nm GreN

7、e : 543nm; HeNe: 633nm Ar激光器激光器(UV): 361nm 激光器的特点激光器的特点: 1) 方向性好方向性好: 激光基本延直线传播激光基本延直线传播 2) 单色性好单色性好 :=10-8nm 3) 高亮度高亮度: 激光方向性好激光方向性好, 其在空间上的能量分布是高度其在空间上的能量分布是高度 集中的。集中的。 4) 偏振性偏振性: 激光为平面偏振光激光为平面偏振光, 光纤耦合光纤耦合激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术5. 四个荧光通道四个荧光通道, 一个透射光通道一个透射光通道 即除了可同时采集多标记荧光图像外即除了可同时采集多标记荧光图像外还可以同时采

8、集透射光图像还可以同时采集透射光图像,但透射光但透射光图像为图像为非共焦图像非共焦图像。 是共聚焦显微镜最基本的功能 可来自单标和多标样本 往往采用固定后的组织或细胞标本；活细胞也可进行特定时间点的单张光学切片1 单张光学切片功能vestigial apterousCiD (cyanine 5). Not just the structure of a single cell, the relationship of adjacent cells at different plane can also be viewed clearly like below: 可用于活细胞或固定细胞的观察、分

9、析2 2 细胞显像细胞显像CriteriaFixed CellsLiving CellsLimits of illuminationFading of fluorophorePhototoxicity and fading of dyeAntifade reagentPhenylenediamine, etc.NONE!MountantGlycerol (n = 1.51)Water (n = 1.33)Highest NA lens1.41.2Time per imageUnlimitedLimited by speed of phenomenon;light sensitivity of

10、specimenSignal averagingYesNoResolutionWave opticsPhoton statisticsHertel L.A., Stricker S.A. and Loker E.S. 2000. Calcium dynamics of hemocytes of the gastropod Biomphalaria glabrata: effects of digenetic trematodes and selected bioactive compounds. Invertebrate Biology, v. 119(#1): 27-37. 腹足纲一种淡水螺Biomphalaria gla