实验---蛋白质的沉淀反应与颜色反应

1、实验 蛋白质的沉淀反响与颜色反响一、实验目的掌握鉴定蛋白质的原理和方法。 熟悉蛋白质的沉淀反响，进一步 熟悉蛋白质的有关反响。二、实验原理蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同， 颜色反响亦不完全相同。颜 色反响不是蛋白质的专一反响，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色 反响，因此不能根据颜色反响的结果来决定被测物是否为蛋白质。另外，颜色反响也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，但 其稳定性是有条件的，相对的。如果条件发生了变化，破坏了蛋白质 的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来

2、。三、实验仪器1、吸管 2、滴管 3、试管 4、电炉 5、pH试纸 6、水浴 锅7、移液管四、实验试剂1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤， 滤液放在冰箱里冷藏备用。2、0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。3、Millon试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸水浴加温助溶溶 解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂可 长期保存。4、尿素晶体5、1%CuS(O： 1g CuSOO晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml6、10%NaOH 10g NaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml7、浓硝酸8、0.1%茚三酮溶液：茚三酮溶于 95%的乙醇并稀释至100

3、ml.9、冰醋酸10、浓硫酸11、饱和硫酸铵溶液：100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。12、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。13、95%乙醇。14、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml15、氯化钠晶体16、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml17、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。18、1%醋酸溶液。五、实验步骤蛋白质的颜色反响一 米伦Millon ' s反响1、苯酚实验：取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加Millon试剂， 电炉小心加热观察颜色变化。2、蛋白质实验：取2ml蛋白液，加Millon 试剂，出现白色的 蛋白质沉淀，小心

4、加热，观察现象。二双缩脲反响1、取少量尿素晶体放在枯燥的试管中，微火加热熔化，至重新 结晶时冷却。然后加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% CuSO 溶液，混匀，观察现象。2、取蛋白液1ml，力口 10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% CuSO溶液，混匀，观察现象。三黄色反响取一支试管，参加1ml蛋白液及浓硝酸5滴。加热，冷却后注意 颜色变化。然后再参加10%NaOH溶液1ml，观察颜色有什么变化。四茚三酮反响取蛋白液1ml于试管中，加4-8滴茚三酮溶液，加热至沸，即有 蓝紫色出现。蛋白质的沉淀一蛋白质的盐析作用1、试管中加蒸馏水3ml，加固体硫酸铵至饱和。另一支试管

5、加 蛋白液2ml，再参加饱和硫酸铵溶液2ml，摇匀静置观察现象。2、将上述混合液过滤。向滤液中逐渐参加少量固体硫酸铵，直 至饱和为止，此时析出为清蛋白。再参加少量蒸馏水，观察沉淀是否 溶解。二有机溶剂沉淀蛋白质试管中加蛋白液1ml，加晶体氯化钠少许，溶解后加95%乙醇3ml, 摇匀，观察现象。三重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质1、取试管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸铅溶液， 另一支管中滴加1%硫酸铜溶液，至有沉淀产生。2、取一支试管加蛋白液2ml，再参加10%三氯乙酸1ml，充分混 匀，观察结果。四生物碱试剂沉淀蛋白质取一支试管，参加蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加饱和苦味酸数 滴

6、，观察现象。六、实验结果蛋白质的颜色反响一 米伦Millon ' s反响1、苯酚实验：溶液即出现玫瑰红色。2、蛋白质实验：出现白色的蛋白质沉淀，小心加热后凝固的蛋白质出现红色。二双缩脲反响1、有紫色出现2、溶液有蓝紫色出现三 黄色反响先有黄色沉淀生成，参加10%NaOH溶液1ml后颜色变为橘黄色。四茚三酮反响有蓝紫色出现。蛋白质的沉淀一蛋白质的盐析作用1、有蛋白析出。2、有蛋白质析出，加水后可复溶。六有机溶剂沉淀蛋白质取一试管加蛋白液1ml，参加晶体氯化钠少许，待溶解后再加95%乙醇3ml,摇匀，观察现象七重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质取试管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸

7、铅溶液, 另一支管中滴加1%硫酸铜溶液，至有沉淀产生。八生物碱试剂沉淀蛋白质取一支试管，参加蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加饱和苦味酸和 鞣酸数滴，观察现象。七、实验分析蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同， 颜色反响亦不完全相同。其中米伦试剂能与苯酚及某些二羟基苯衍生物起颜色反响，而组成蛋白质的氨基酸中酪氨酸含苯酚基团，因此可用米伦试剂检测蛋白质中 酪氨酸的存在。尿素被加热，形成双缩脲，在碱性环境中，能与硫酸 铜结合成紫色的化合物，此反响称为双缩脲反响。蛋白质分子中含有 肽键与缩脲结构相似，也能进行此反响。蛋白质分子中含有苯环结构 的氨基

8、酸如酪氨酸、色氨酸等，于浓硝酸可反响并生成黄色物质， 此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物硝醌酸等。蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的复原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反 应为一切蛋白质及a-氨基酸所共有。亚氨基酸脯氨酸和羟脯氨酸 与茚三酮反响呈黄色，含有氨基的其他物质亦呈此反响蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水 化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。如果条件发生了变化， 破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。向蛋白质中 参加大量的中性盐硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等，使蛋白质胶体颗 粒脱水，破坏其水化层，同时它所带有的电荷亦被中性盐上所带的相 反电荷的离子

9、所中和。于是稳定因素被破坏，蛋白质聚集沉淀。盐析 作用一般不使蛋白质变性。某些有机溶剂如乙醇、甲醇、丙醇等， 因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相 互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。重金属离子如P&+、C&+ 等与蛋白质的羧基等结合生成不溶性的金属盐类而沉淀，同时蛋白质发生变性。某些有机酸的酸根那么与蛋白质的自由氨基结合而沉淀。植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物成为生物碱。能沉淀生 物碱或与其产生颜色反响的物质称为生物碱试剂，如鞣酸等。当溶液 PH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂的负离 子发生反响而沉淀。蛋白质变性protein

10、 d enaturation 是指蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被改变，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失。一般认为蛋白质的二级结构和三级结构 有了改变或遭到破坏，都是变性的结果。能使蛋白质变性的化学方法 有加强酸、强碱、重金属盐、尿素、乙醇、丙酮等；能使蛋白质变性 的物理方法有加热高温、紫外线及X射线照射、超声波、剧烈振荡 或搅拌等。如果变性条件剧烈持久，蛋白质的变性是不可逆的。如果变性条 件不剧烈，这种变性作用是可逆的。这时，如果除去变性因素，在适 当条件下变性蛋白质可恢复其天然构象和生物活性，这种现象称为蛋白质复性renaturation。例如胃蛋白酶加热至809

11、0C时，失去 溶解性，也无消化蛋白质的能力，如将温度再降低到37C,那么又可恢复溶解性和消化蛋白质的能力。蛋白质变性的应用价值医学：临床上的消毒和灭菌-使病原微生物变性注射及外伤采用75沱醇灭菌手术器械及其它用品米用咼温咼压火菌手术室用紫外线灭菌用热凝法检查尿蛋白实验室：防止蛋白质变性：在生产和保存激素、酶、抗体血清等具有生物 活性的蛋白质如酶、疫苗、免疫血清等时，应防止其变性失活， 其中在低温条件下生产与贮存以上蛋白质就是这个道理。实验室的灭菌：细胞培养室等亦用紫外线照射消毒灭菌。日常生活：熟食较生食易消化：因为蛋白质变性后，肽链构象由卷曲变为伸展， 使肽健暴露，易被蛋白水解酶消化水解。其中

12、盐析法作为一种蛋白质胶体简便的提取手段被广泛应用于 工业生产。盐析法是在中药水提液中，参加无机盐至一定浓度，或达饱和状 态,使某些成分在水中溶解度降低，从而与水溶性大的杂质别离。如向蛋白质溶液中参加某些浓的无机盐 如(NH4)2SO4或Na2SO4 溶液后，可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出，这种作用就叫做盐析。 这样析出的蛋白质仍可以溶解在水中，而不影响原来蛋白质的性质。 因此，盐析是一个可逆的过程。利用这个性质，可以采用屡次盐析的 方法来别离、提纯蛋白质蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子外表离子周围的 水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。 蛋白质溶液中参加中 性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质， 致使蛋白质分子 周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐参加蛋白质溶液后由于离 子强度发生改变，蛋白质外表的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶 解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于各种蛋白质在不同盐 浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶