电化学方法测定羟自由基反应速度常数

1、第32卷第3期2002年6月中国科学技术大学学报JOURNA L OF UNIVER SIT Y OF SCIENCE AN D TECHN OLOG Y OF CHINA Vol. 32,No. 3Jun. 2002文章编号:025322778(2002 0320288205袁倬斌1, 邹2(1. 中国科学技术大学研究生院化学系, , 北京100037 摘要:在维生素C A 22, 在( DA 与甲醛、氨通过Hantzsch 反应, 生成产物3,52二甲酰. “清除剂”, 用电化学方法监测3,52二甲酰21,42二, 以此求得羟自由基“清除剂”与羟自由基反应的反应速度常数.关键词:Hantz

2、sch反应; 羟自由基; 反应速度常数; 电化学法中图分类号:O657.1文献标识码:A0引言近年来人们越来越重视由超氧阴离子自由基、H 2O 2等活性氧中间体对人体的损伤而导致的各种疾病. 其中这些活性氧中间体与一些金属离子作用会产生毒性更强的羟自由基, 其对生物靶分子如DNA 或生物膜造成危害, 则会引起某些疾病的发生或恶化, 如癌症、衰老、炎症等损伤.为了研究各种“羟自由基清除剂”的清除能力, 需要寻找简单、便捷的测定“羟自由基清除剂”与羟自由基反应的二级反应速度常数的方法. 目前常见的方法是通过Fenton 反应中产生的羟基自由基与脱氧核糖反应, 使脱氧核糖降解, 在酸性溶液中加热可生

3、成M DA ,M DA 再与22硫代巴比妥酸(T BA 反应生成红色产物, 测定M DA 2T BA 加合物在532nm 处的最大吸收. 如果先加入清除羟自由基的抗氧化剂, 则M DA 的生成量将会减少, 由此计算抗氧化剂与羟自由基反应的二级反应速度常数, 评价其清除羟自由基的能力1. 但是糖类、氨基酸和其它脂肪酸过氧化物也可与T BA 产生真正的T BA 2M DA 加合物, 所以T BA 试验缺乏特异性, 后来人们将T BA 试验与HP LC 法相结合, 测量则更精确并更具有特异性2.由于M DA 与醛类化合物、一级胺类化合物相互作用, 通过Hantzsch 反应生成3,52二醛基21,4

4、2取代的二氢吡啶化合物35, 本文利用脱氧核糖与在Fenton 反应中产生的羟自由基作用, 经过降解生成M DA ,M DA 再与甲醛、氨相互作用, 生成具有电化学活性的3,52二甲酰21,42二氢吡啶, 通过监测Hantzsch 反应产物(3,52二甲酰21,42二氢吡啶 的还原峰, 建立了收稿日期:2000209227基金项目:国家自然科学基金(29875027;29675022 、中科院长春应用化学研究所电分析化学开放实验室基金(OC980003;OC200001 、北京市教委基金和北京市自然基金(22972003 资助项目作者简介:袁倬斌, 男,1938年生, 教授, 博士生导师.第3

5、期电化学方法测定羟自由基反应速度常数289用于考察抗氧化剂清除羟自由基活性和测定抗氧化剂与羟自由基反应的反应速度常数的电化学方法, 并研究了3,52二甲酰21,42二氢吡啶的电化学行为.1实验部分1. 1仪器和试剂MP 21型溶出伏安仪; 滴汞电极为工作电极, ; M odel 264A 电化学分析仪(EG &G PARC :303, 铂丝为对电极;pH 2C 型数字pH 计.脱氧核糖(DR :110-3m ol/L ; H 2O 3, 实验用水为二次去离子水.1. 21. 2. 1在10(DR (110-3m ol/L 、0. 1m L 1. 2%H2O 2、510-3m ol/L Vc 、

6、210-4m ol/L Fe 3+、2. 1010-4m ol/L E DT A 和0. 1m ol/L KH 2PO 4+Na 2HPO 4(pH =7. 4 缓冲液, 总体积为6m L , 于37恒温槽中加热30min.1. 2. 2Hantzsch 反应取出比色管, 加入4m L 0. 1m ol/L HCl 停止Fenton 反应, 于100沸水中加热10min , 以便使M DA 完全生成, 然后取出1m L 溶液于另一支10m L 具塞比色管中, 加入0. 1m L 1%甲醛溶液, 再加入0. 04m ol/L NH 3H 2O +0. 4m ol/L NH 4Cl 缓冲液至刻度,

7、 于100加热10min 后, 取出冷却, 将溶液转入电解池中进行测量.2结果与讨论2. 1脱氧核糖降解过程和H antzsch 反应脱氧核糖降解过程:Fe 2+2E DT A +O 2=Fe 3+2E DT A +O 2-2O 2-+2H +H 2O 2+O 2Fe 2+2E DT A +H 2O 2OH -+OH +Fe 2+2E DT AOH +脱氧核糖碎片酸化、加热M DAHantzsch 反应:M DA +CH 2O +NH 33,52二甲酰21,42二氢吡啶2. 2反应条件的选择脱氧核糖与羟基自由基反应后形成脱氧核糖过氧化物, 在酸性条件下加热, 生成M DA 2. 如果向溶液加入

8、NaOH 溶液, 使溶液的pH 为12, 此时可观察到M DA 在-1. 35V (vs. SCE 处有一个还原峰, 但是该峰的灵敏度不高, 而且有一些中药中的有效成分的还原峰会产生干扰, 所以本文选择通过Hantzsch 反应, 使M DA 转变为3,52二甲酰21,42二氢吡啶. 实验发现:在Hantzsch 反应中,pH 在4. 06. 0范围之间, 均可生成3,52二甲酰21,42二氢吡啶, 得到峰P 1、P 2这两个峰高大致相同的还原峰(-0. 60V , -0. 80V (图1 , 在pH =2. 00中国科学技术大学学报第32卷2902. 40范围内, 峰P 1、P 2的峰电流与

9、pH 无关, 而pH 在2. 406. 0之间, 峰P 1、P 2的E p/ pH 分别为-60mV 和-88mV. 用该方法所得峰P 1、P 2的峰电流灵敏度是在强碱条件下M DA 还原峰电流的20倍左右. 实验结果表明:加热时间至少需要8min 才能使Hantzsch 反应完全进行, 所以本择进行Hantzsch 反应的pH 0加热时间; 阳离子型表面活性剂四丁基碘化铵、阴离子型表面活性剂十二烷基硫酸钠、非离子型表面活性剂Triton X 2100均使峰P 1、P 2有不同程度下降; 峰P 1、P 2的常规脉冲极谱曲线均呈峰形; 峰P 1的%/ 为2. 0(10 、 、 , 峰P 2的温度

10、系数(191. 1(2033-0. 12(3442、 、 , 这些实验结果表温度系数为0. 7(10231. 7(1023-0. 62(3435明峰P 1、P 2具有吸附性质.2. 3. 2电极反应的电子转移数(n 和质子转移数(m 通过对峰P 1、P 2的i 2E 曲线进行半对数分析, 得到一条直线(峰P 1 和一条折线(峰P 2经计算求得:n 1=2. 0、n 2=2. 0、 P 2的半峰宽度分别为42. 7mV 2=0. 62, 实验得到峰P 1、和52. 0mV , 根据可逆和不可逆吸波的半峰宽公式W 1/2=90. 6/n (可逆 和62. 5/n (不可逆 , 也可求得n 1=2.

11、 0, pH 的关系, 求得m 1=2、2n 2=1. 20、2=0. 62, 再根据E p /m 2=2. 图1Hantzsch 极谱图( of the Hantzsch (pH =5. 0 为10min. 2. 32. 121,42二氢吡啶溶液的电毛细管曲2. 3. 3电极反应机理综上实验推测电极反应机理为:表1葡萄糖与羟基自由基反应的反应速度常数T ab. 1The reaction rate constants of glucose with hydroxyl radicals -1K S /109M -12. 12. 65T BA 2M DA 法11. 02. 0T BA 2M DA

12、 法11. 01. 81. 7方法本法脉冲光解法1二甲亚砜法62. 4应用在Fenton 反应中, 若有某种抗氧化剂与羟基自由基反应, 则其与脱氧核糖相互竞争, 与羟基自由基反应, 这样M DA 的量就会减少, 根据M DA 的减少量, 可得出该物质清除羟基自由基的能力. 抗氧化剂与羟自由基反应的二级反应速度常数可由下面公式得出:第3期电化学方法测定羟自由基反应速度常数291i 0/i =1+K S S/K DR DRi 0为无抗氧化剂时3, 52二甲酰21, 42二氢吡啶时还原峰的峰电流, i 为有抗氧化剂存在时还原峰的峰电流,DR为脱氧核糖的浓度,K DR 为脱氧核糖与羟基自由基反应的二级

13、反应速度常数, 等于1. 9109M -1s -11,S为抗氧化剂清除剂的浓度, K S 为清除剂与羟基自由基反应的二级反应速度常数. (表1 , 实验结果表明, 本法的结果与文献值基本吻合.如果该物质是中药中的有效成份, 可通过监测3,51,42化, 求出该有效成份清除羟基自由基的Ic 50(. 表2Ic 50和反应速度常数, 其中与O 2-反应的Ic .表2O 2-和OH 的Ic 50及其与OH 反应的反应速度常数T ab. 50of consituent in Chinese T raditionanl Herbal Drugs with for hydroxyl radicalanio

14、n radical and their reaction rate constants which react with hydroxyl radical化合物槲皮素穿心莲内酯土木香内酯甘草酸甘草次酸清除O 2-的925363038清除OH 的429610089105与OH 反应的10-1-1与OH 反应的10-1-14. 01. 81. 71. 91. 61106参考文献cence of 1, 42dihydropyridine derivatives relevantto age pigments J .Chem. Pharm. Bull. ,1987,35:465624660. 1Hal

15、liwell B , G utteridge J M C , Aruoma O I. The deoxyribose method :a simple “test 2tube ”assay for determination of rate constants for the reactionsof hydroxyl radicalsJ.Anal. Biochem. , 1987,165:2152219.2Cheeseman K H , Beavis A , Hermann E. Hydrox 2yl 2radical 2induced iron 2catalysed degradation

16、ofdeoxyriboseJ.Biochem. J. , 1988, 252:6492653.3K ikugawa K, K ato T , I wata A. Determination ofmalonaldehyde in oxidized lipids by the Hantzschfluorometric method J.Anal. Biochem. , 1988,174:5122521.4K ikugawa K, Nakahara T , Sakurai K. Fluores 25Nalr V , O fferman R J , Turner G A , et al. Fluo 2

17、rescent 1,42dihyropyridines :the malondialdehyde connection J .T etrahedron , 1988, 44(10 :279322803. 6Rekka E , K ourounakis P N. E ffect of hydroxyethyl rutosides and related compounds on lipid peroxida 2tion and free radical scavenging activity. S ome structural aspects J .J Pharm. Pharmacol. , 1

18、991, 43:4862491. 7邹洪, 袁倬斌. 邻苯三酚自氧化的电化学研究J.分析试验室,1997,16(4 :125.中国科学技术大学学报第32卷292A Simple Assay for Determination of R ate Constants for R eactions of H ydroxyl R adicals by E lectrochemical MethodY UAN Zhuo 2bin 1, Z OU H ong 2(1. Department o f Chemistry , Graduate School , Chinese Academy o f , (2

19、. Department o f Chemistry , Capital Normal Abstract :Hydroxyl radicals , generated by an plex with H 2O 2in the pres 2ence of ascorbic acid , attack to (M DA at low pH. M DA can react with formaldehyde conditions to form 1,42dihydropyrindine 23,52dicar 2“scavengers ”com pete with deoxyribose for the hydroxyl radicals produced 1,42dihydropyrindine 23,52dicarbaldehyde formation. A rate constan