枯草杆菌弹性蛋白酶高产菌株的筛选与鉴定-

1、收稿日期:2001-03-12作者简介:王金英(1964-,女,实验师,大专,从事食品酿造、保健食品研发工作,获省级奖1项,发表论文10篇。中图分类号:Q93-331文献标识码:A 文章编号:1004-311X (200102-0030-03枯草杆菌弹性蛋白酶高产菌株的筛选与鉴定王金英,刘宇峰,孙岸弢(黑龙江省科学院应用微生物研究所黑龙江哈尔滨150010摘要:从稻草中初筛出14株具有溶解弹性蛋白作用的G +产芽孢杆菌,经分离纯化筛选诱变,并进行生理生化鉴定后,得到2株产酶活较高的枯草芽孢杆菌B.subtilis HW236-5和HW245-1,作为制备抗动脉粥样硬化枯草杆菌弹性酶的产酶菌株。

2、关键词:枯草杆菌;弹性蛋白酶弹性蛋白酶(Elastase 是一种以分解不溶性弹性蛋白酶为特征的广谱蛋白水解酶,是治疗高血脂症,防治动脉粥样硬化症的生化药物。它既可由动物胰脏提取,也可由微生物发酵制得1。来源不同的微生物弹性蛋白酶都能降解其天然底物弹性硬蛋白,作为同功不同源的蛋白酶,其特点、性质、分子量、电点等有所差异,但都是一种广谱的肽链内切酶,具有较广的水解特性2,不仅能降解弹性蛋白,而且对酪蛋白、明胶、血纤维蛋白、血红蛋白、白蛋白等多种蛋白质都能分解,作用效果与胰弹性酶相同相似,本研究筛选出弹性蛋白酶的枯草杆菌产生菌株,以探讨工业化生产的可能性。1材料与方法1.1材料与试剂产品(E -16

3、25;刚果红弹性蛋白(E-lastin -Congo Red ,中国药品生物制品检定所产品。1.2培养基(%:牛肉膏1.0;蛋白胨1.0;蔗糖1.0;NaCl 0.5;琼脂2.0;pH6.8。(%:弹性蛋白0.5;酵母膏0.1;葡萄糖0.1;MgSO 47H 2O 0.01;K 2HPO 40.1;KH 2PO 40.05;琼脂2.0;pH7.0。(%:干酪素3.0;葡萄糖4.0;玉米提取液0.2;K 2HPO 40.2;MgSO 47H 2O 0.01;pH6.0。1.3方法取稻草数根剪碎,放入三角瓶中,加水没过干草,装量不超过瓶容量的1/2,加石灰少许,塞好棉塞,煮沸5min ,杀死无芽孢

4、的细菌,置3037培养48h ,液面出现白色菌膜后,用压滴法观察杆菌的运动,再通过染色法观察菌体及芽孢。取该培养液在平板培养基上涂布和划线,进行菌种分离后,将单菌落划线到斜面培养基上保存备用。取斜面保存的菌种稀释涂布于平板培养基上,形成单菌落后,点种于弹性蛋白初筛平板进行初筛。选择水解弹性蛋白所形成的透明圈直径与菌径之比较大的菌落划线到斜面培养基上,进行摇瓶发酵复筛,测定发酵液弹性蛋白酶的活力。参照中华人民共和国卫生部药品标准二部六册P122P124。诱变法:见文献3。2结果与讨论2.1从稻草中筛出17株可使弹性蛋白溶解的杆菌,经液体培养复筛出4株产酶较高菌株236、245、Na -7、N -

5、12,再对这4株菌进行诱变又得到14株236菌、6株245菌、17株Na -7菌、8株N -12菌,经比较弹性蛋白的溶解透明圈与菌径之比,选取较大的4株菌株进行液体发酵试验,最后选定236-5和245-1作为产弹性蛋白酶菌株,结果见表1。表1产弹性蛋白酶菌株的筛选菌株号透明圈直径与菌径之比蛋白酶活力(u /ml 弹性酶活力(u /ml 236-12.2菌株236-5与245-1的菌落形态及生长特征:236-5和245-1均与B.subtilis 标准菌的特征相同,菌落表面褶皱,圆形,不规则,无光泽,不透明,白色菌落直径2mm -3mm ,粗糙。在1%葡萄糖营养琼脂试管的穿刺表面生长物变厚。2.

6、3菌株236-5与245-1菌体及生理生化特征:试验观察,236-5与245-1的特征均与枯草杆菌的典型特征相同,根据伯杰氏细菌鉴定手册(第八版P732P735,对于典型枯草杆菌的描述,可鉴定为枯草杆菌,遂命名为HW236-5和HW245-1。2.4讨论通过对HW236-5与HW245-1两株菌的产弹性蛋白酶活性和生理生化及菌体菌落特性的大量试验研究,该两株菌与B.subtilis 标准株的菌学特性基本相同,因此可以确定HW236-5与HW245-1两株菌系为枯草芽孢杆菌,并且具有产生弹性蛋白酶的能力,其产酶能力基本与国外5-7报道的其它微生物产弹性菌种相似。同时因为这两株菌营养要求简单,产酶

7、迅速,故极有可能作为微生物弹性蛋白酶的菌株。参考文献:北京:科技出版社,117.2唐宝英,朱晓慧.微生物弹性蛋白酶研究概况J .工业微生物,1998,28(1:40-44.3章名春.工业微生物诱变育种M .第1版.北京:科学出版社,1984,111-127.4中国科学院微生物研究所细菌分类组.一般组药常用鉴定方法M .第1版.北京:科学出版社,1979,111-193.5北京师范大学生物系.怎样改变与培养微生物M .第1版.北京:北京师范大学出版社,1982,925.6Ying Chieh T sai ,Shuen Fuh Lin ,Ywan Feng Li.Characterizationof an alkaline elastase from alkal