灯盏花提取成分对体外高压培养视网膜神经节细胞凋亡基因表达的影响

1、灯盏花提取成分对体外高压培养视网膜神经节细胞凋亡基因表达的影响    摘要   目的   观察灯盏花提取物（DSX）对体外高压培养视网膜神经节细胞凋亡及凋亡基因表达的影响。 方法   （1）在RGCs中加入DSX，加压培养后收集细胞，用流式细胞仪测定凋亡细胞百分率。（2）在RGCs中加入DSX，加压培养后收集细胞，用基因芯片寻找凋亡基因的表达。结果   （1）在RGCs高压培养时，DSX组的凋亡百分率低于模型组和对照组。（2）在高压培养的条件下，与神经元细胞凋亡相关的基因S1

2、00B表达恢复正常，NGFR表达下调。 结论   DSX是具有RGCs保护作用的有效单体，能使高压培养RGCs的S100B的表达恢复正常，NGFR的表达下调。     关键词   视网膜神经节细胞；细胞培养；压力；细胞凋亡    Apoptotic genetic expression of  RGCs by bolting constituent from Herba Erigerontis cultured in vitro by high pressure  

3、      Abstract   Objective   To observe the apoptosis and look for apoptotic gene of RGCs cultured in vitro by high pressure by adding the constituent come from Herba Erigerontis（DSX）.  Methods   We build rat retinal cells and RGCs cultured

4、 in virto by high pressure.Put 80 mmHg pressure to RGCs in close tightly culturebottle for four hours， then collect RGCs and check the sum of apoptosis cells by flow cytometry(FCM).Put the pressure 80 mmHg to RGCs in close tightly culturebottle for four hours，then collect RGCs and look for the apopt

5、otic gene by gene chip. Results   The apoptosis of model group and control group higher than DSX group cultured  in the pressure of 80 mmHg.Two apoptotic gene (S100B，NGFR) express upregulation. Conclusion   DSX was the most effective constituent in protecting RGCs in vitro.T

6、he expressing upregulation of  S100B and NGFR is the direct reasons of the apoptosis of RGCs by pressure.    Key words   retinal cells;retinal ganglion cells; cell culture;pressure;apoptosis     青光眼系具有病理性高眼压或正常眼压合并视乳头、视网膜神经纤维层损害及青光眼性视野改变的一种致盲性的眼病，目前临床疗效不理

7、想，尤其是控制眼压后，患者视功能仍然继续下降，所以寻找对视神经具有保护作用的药物成为新的要求。DSX是从中药灯盏花中提取的有效成分。目前已证明以DSX为主要组分制备的优视胶囊具有活血化瘀、通窍明目的作用，能保护高眼压状态下的RGCs免受或少受损伤并挽救凋亡细胞1，2，在此基础上，我们希望能明确其作用机制，为进一步研究的剂型做准备。    1   材料与方法    1.1   实验动物   SD乳鼠（13日龄），由成都中医药大学动物实验中心提供。  

8、0; 1.2   主要试剂   层粘连蛋白（ROCHE公司）、多聚鸟氨酸、硼酸、硼砂（沈阳化学试剂厂）、胰蛋白酶、DMEM培养基（GIBCO公司）、羊抗鼠IgG（华美生物工程公司）、小鼠抗大鼠单克隆抗体和PI（SIGMA公司）、DEPC（Sigma公司）、trizol（Invitrogen公司）、EDTANa2（国药集团化学试剂有限公司）NucleoSpin RNA cleanup试剂盒（MACHEREYNAGEL，Germany）等。DSX由中药灯盏花提取。    1.3   主要仪器 

9、60; HBO50型倒置相差显微镜（德国ZEISS公司）、超净工作台（苏州医疗器械厂）、MCO-150A型二氧化碳培养箱（日本三洋公司）、大鼠Oligo芯片、LuxScan 10KA双通道激光扫描仪（CapitalBio公司）等。    1.4   培养器皿的制备   25 cm2培养瓶和直径35 mm培养皿（内置盖玻片），以0.1 mg/ml多聚鸟氨酸（polyLornithine，硼酸缓冲液稀释）室温包被2 h后，再以4 g/ml层粘连蛋白(laminin， PBS液稀释)包被，37 过夜备用。以羊抗鼠IgG（1100，

10、PBS液稀释）室温包被培养皿24 h，继以小鼠抗大鼠Thy-1.1单克隆抗体（1150，PBS液稀释）室温包被24 h。    1.5   RGCs的培养   出生13天SD乳鼠20只断头处死，无菌条件下取眼球，体视显微镜下钝性分离视网膜，0.125%胰蛋白酶消化20 min，用220目网眼无菌钢网滤过，小牛血清终止消化，1000 r/min离心5 min，去上清，加20%DMEM培养液，用吸管反复吹打，使细胞分散均匀，制成细胞悬液后加入经羊抗鼠IgG和小鼠抗大鼠Thy-1.1单克隆抗体包被的培养皿，37 条件下孵育30 m

11、in，使视网膜神经节细胞与Thy-1.1单克隆抗体充分结合，去上清，用无血清培养液反复漂洗，清除培养皿表面未黏附的细胞，用0.125%胰蛋白酶消化10 min，小牛血清终止消化，1000 r/min离心5 min，去上清，加20%DMEM培养液，用吸管反复吹打，使细胞分散均匀，制成细胞悬液。计数后按每瓶5×105个细胞加入经多聚鸟氨酸和粘连蛋白包被的培养瓶和培养皿。    1.6   视网膜神经节细胞体外培养   按以上方法制备的纯化RGCs，培养24 h后，取出培养皿内置的盖玻片，固定，用Pischinger法进

12、行鉴定。    按以上方法制备的纯化RGCs 18瓶，培养24 h后随机分为3组，实验组加入DSX（终浓度0.1 mg/ml），模型组和空白对照组不加药物，实验组和模型组用带T型三通管的橡皮塞将培养瓶密闭，用打气球从T型三通管注入除菌空气，从与培养瓶相通的压力表中读取压力值，达到预定的80 mmHg，加压时间4 h，空白对照组不加压，37 ，5%CO2孵箱培养，并在规定时间取出，利用流式细胞仪进行凋亡细胞的检测。    按以上方法制备的纯化RGCs 30瓶，培养24 h后随机分为3组，每组10瓶，实验组加入DSX（终浓度0.1 mg/

13、ml），模型组和空白对照组不加药物，实验组和模型组用带T型三通管的橡皮塞将培养瓶密闭，用打气球从T型三通管注入除菌空气，从与培养瓶相通的压力表中读取压力值，达到预定的80  mmHg，加压时间4 h，空白对照组不加压，37 ，5%CO2孵箱培养，并在规定时间取出，利用基因芯片进行凋亡基因的检测。    1.7   统计学方法   采用SPSS 14.0版统计软件包进行统计，多组间比较用单因素方差分析，多组间两两比较用q检验，差异基因的表达用t检验。    2   结果    2.1   视网膜神经节细胞的鉴定结果   Nissel小体染色检查：免疫组化染色结果显示细胞胞浆内有蓝色颗粒，证实细胞类型为神经元细胞。因此，依据细胞的组织来源、细胞的形态以及免疫组化染色结果可判断此种细