浅议双歧杆菌脂磷壁酸延缓细胞衰老的作用

1、浅议双歧杆菌脂磷壁酸延缓细胞衰老的作用        【摘要】目的 探讨双歧杆菌脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)在延缓H2O2诱导细胞衰老中的作用。方法 H2O2诱导WI38细胞衰老,半乳糖苷酶细胞化学染色计算衰老细胞百分率变化,RTPCR和Western印迹检测衰老细胞p21、细胞周期蛋白E(cyclin E)和周期蛋白依赖性蛋白激酶2(CDK2)表达水平的变化。结果 双歧杆菌LTA处理后,半乳糖苷酶细胞化学染色阳性细胞百分率较衰老模型组降低(P<0.01)。与年轻对照组相比,衰老模型组细胞中p

2、21的表达增高,cyclin E和CDK2表达降低,而双歧杆菌LTA能够逆转上述变化(P<0.01)。结论 双歧杆菌能延缓H2O2诱导的细胞衰老,机制可能与改变p21,cyclin E和CDK2表达水平有关。     Effect mechanism of lipoteichoic acid of Bifidobacterium on delaying cell aing     PENG YanHua, WANG Yue, LIU JianLong, et al.     Key Laborato

3、ry of Laboratory Medical Diagnostics of Ministry of Education, Department of Laboratory Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China     【Abstract】  Objective  To explore the effect of lipoteichoic acid (LTA) of Bifidobacterium on delaying cell aging induc

4、ed by H2O2. Methods  WI38 cell aging was induced by H2O2. galactosidase (gal) cytochemistry staining was used to evaluate the percent of aging cell the mRNA protein levels of p21, cyclin E CDK2 were detected by RTPCR Western blot. Results  Treatment with LTA(5, 10 g/ml)led to a significant

5、 increase in the proportion of galpositive cells (P<0.01) markedly decreased the mRNA protein levels of p21 increased the mRNA protein levels of cyclin E CDK2 in WI38 cells in aging model group (all P<0.01). Conclusions  LTA of Bifidobacterium can delay cell aging induced by H202, whose m

6、echanism may have relation with change the expressions of p21, cyclin E CDK2.     【Key words】  Bifidobacterium; Lipoteichoic acid; Cellaging; H2O2     在体外,人胚肺二倍体成纤维细胞已成为经典的复制性细胞衰老模型,而多种刺激物能诱导年轻细胞出现与复制性衰老相似的特征,被称为应激诱导早熟性老化(stressinduced premature senescence,SIPS),其中

7、H2O2是最常用的氧化应激引发细胞SIPS诱导剂1,2。双歧杆菌的表面分子脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)已被证实具有抗氧化的作用,能够有效延缓衰老3,但其机制并不是很清楚。本研究用H2O2诱导人胚肺成纤维细胞WI38出现SIPS,观察双歧杆菌LTA是否具有抗细胞衰老的作用,以及WI38细胞中p21、CDK2和cyclin E mRNA和蛋白表达水平的变化,探讨双歧杆菌LTA抗细胞衰老的细胞周期调控机制。     1  材料和方法     1.1 材料     双歧杆菌LT

8、A由本实验室参考Sutcliffe法4从两歧双歧杆菌中提取,人胚肺成纤维细胞WI38细胞(20代)购于中国科学院细胞库,胎牛血清和MEM培养基购自美国Gibco公司,H2O2购自Sigma公司;p21、CDK2、cyclin E和GAPDH引物序列由Invitrogen公司合成,RTPCR试剂盒购自Promega公司,p21、cyclin E单克隆抗体和CDK2多克隆抗体购自北京中山公司,衰老特异性半乳糖苷酶原位染色试剂盒,购自上海杰美公司,Western印迹化学发光检测试剂盒购自美国KPL公司。     1.2 方法     1.2

9、.1 细胞培养     WI38细胞接种于含10%胎牛血清的MEM培养基(另外加入2 mmol/L谷氨酰胺,1.0 mmol/L丙酮酸钠,0.1 mmol/L非必需氨基酸),置37,5% CO2条件下培养至2235代用于实验。     1.2.2 细胞处理5和分组  模型组将细胞接种于24孔培养板,每孔2×105个细胞,待细胞长满培养板的70%左右(避免细胞汇合),加160 mol/L H2O2作用2 h,用无血清培养基清洗3次,再加入10%胎牛血清的培养基培养72 h;双歧杆菌LTA处理组在加160 mol/L

10、H2O2同时分别加入5、10、20 g/ml LTA, 同时做年轻对照组。     1.2.3  半乳糖苷酶细胞化学染色     按照说明书操作,染成蓝色的细胞为半乳糖苷酶染色阳性细胞,每组同时做4个复孔,每孔计数400个细胞,计算半乳糖苷酶染阳性百分率。     1.2.4  p21、cyclin E和CDK2 mRNA表达水平     逆转录参阅Promega RT说明书:2 g RNA+0.5 g olig(dT)+无RNAase水,终体积15 l,

11、70 变性5 min,立即放进冰中冷却,随后在上述体系中加入MMLV 1 l,dNTP 1.25 l,RNAase 0.6 l,MMLV 5×缓冲液 5 l,加水至25 l,42 60 min,95 5 min,冰浴5 min。PCR的反应体系:PCR缓冲液5 l,MgCl2 1.8 l,灭菌水19.4 l, Promega Taq酶0.2 l,上游引物1 l,下游引物1 l, dNTP 0.6 l,cDNA 2 l,共30 l。引物序列见表1。PCR反应条件:为94 3 min预变性;94 35 s,59 35 s(p21,cyclin E和CDK2), 61 30 s(GAPDH

12、),72 45 s,32个循环;72 5 min;取PCR扩增产物5 l上样于10 g/L琼脂糖电泳,在BioRad凝胶成像仪上观察并保存结果,光密度分析。表1  引物序列及扩增产物大小(略)     1.2.5  p21、cyclin E和CDK2蛋白表达水平     处理后的细胞用预冷的细胞裂解液提取蛋白,用蛋白提取液样品作SDSPAGE电泳后转膜,封闭, 转至PVDG膜,室温下封闭2 h后,一抗(1200稀释)4下孵育过夜,0.01 mol/L PBST洗涤5次,每次5 min,与二抗(11 000稀释)室温

13、下孵育2 h,洗涤后用ECL化学发光系统检测,待条带显示清楚后终止反应。结果用quantity one软件分析。     1.3 统计学处理     实验数据以x±s表示,采用SPSS 12.0软件分析,多组间均数比较用单因素方差分析。     2 结 果     2.1 双歧杆菌LTA对H2O2诱导细胞衰老的影响     衰老模型组的半乳糖苷酶阳性细胞率(71%)明显高于青年对照组(10%)和5 g/ml LTA处理组(21%)及10

14、 g/ml LTA处理组(35%)(P<0.01),表明双歧杆菌LTA能够延缓由H2O2诱导的细胞衰老,但20 g/ml LTA处理组(69%)无明显作用。见图1。     2.2  双歧杆菌LTA对WI38细胞中p21、cyclin E和CDK2 mRNA表达的影响     与年轻对照组比较,模型组WI38细胞的p21 mRNA表达显着增加(P<0.01),cyclin E和CDK2 mRNA表达明显下降(P<0.01);经5 g/ml和10 g/ml双歧杆菌LTA处理后,其细胞内p21 mRNA表达较模型组明显下降(P<0.01),cyclin E和CDK2 mRNA表达较模型组明显增高(P<0.01),其中尤以5 g/ml LTA组变化最明显。见表2、图2。表2  双歧杆菌LTA对WI38细胞中p21、cyclin E和CDK2 mRNA表达的影响(略)     2.3  双歧杆菌LTA对H2O2诱导WI38细胞衰老过程中蛋白表达的影响     与年轻对照组比较,模型组WI38细胞的p21 蛋白