酵素连结免疫吸附法

1、ELISA( enzyme-linked immunosorbent assay )酵素連結免疫吸附法自然界有許多專一性的配對分子，例如：兩股 DNA 分子間的鹼基配對、酵素與其基質間的結合與催化、各種荷爾蒙與其受體、抗原與其抗體的結合等。其中，抗原與抗體的專一性配對，可用人為的設計與免疫操作，在實驗室中取得專一性的抗體；這是目前極少數可用人工產生專一性分子探針的方法之一。抗體與抗原之間的高度專一性，一直吸引著研究學者的注意力；對於抗原抗體間的專一結合關係，免疫學家自百年前已從免疫沈澱法清楚觀察，後來又發展出 雙向免疫擴散 (double diffusion)，以及 酵素免疫分析法 (enzy

2、me-linked immunosorbent assay, ELISA)，成為免疫化學的標準工具。這些免疫工具與方法，到現在都還應用在基礎研究，或產業界的各種檢驗及醫療用途上。ELISA是在1971年首次由Engvall和Perlman所介紹。不論是測抗原或抗體都有很高的敏感性及專一性，且使用設備相較之下少了許多。固相吸附准許unbound reagents快速且完全地清洗。是一種安全又穩定的方法。酵素連結免疫分析法已日益普及，因為非常靈敏且不必如免疫螢光術和放射免疫分析法需要特殊設備。此法的原理是以一種酵素連結到抗原或抗體上，用酵素活性來做為定量標記。有許多方法已經架構完成，視使用的酵素性

3、質及待測的抗原-抗體系統而定。其中廣泛使用的便是酵素連結免疫吸附分（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA），可以測定抗原或抗體。酵素連結免疫吸附法( enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA )的原理是依據螢光抗體方法發展出來的，它是將酵素連接到抗原或抗體分子上來偵測抗原抗體反應，最後加上酵素的受質，依其呈色強弱來表示。ELISA可以用來測抗原或抗體的量，例如要測定抗體，則將抗原連接到一固定物上，先加檢體後，再加酵素連接的免疫球蛋白，如此測得之酵素活性即代表抗體量之高低。脊椎動物對外來的異物會產生抗體來清除之，

4、這些外來異物稱為抗原，包括細菌或者各種巨大分子；尤其蛋白質是相當強的抗原，很容易誘生出專一性抗體。 但一個抗體分子只與蛋白質分子上的一小段胺基酸鏈結合，大約在六到十來個胺基酸長度，這一小段蛋白稱 抗原決定基 (antigenic determinant 或 epitope)。因此，一個分子量較大的蛋白質，可能有數個抗原決定基，可以誘生數種不同的抗體分子，稱為多價抗原 (multivalent antigen)。而在生物體內，是由一種稱為 B 細胞的白血球負責抗體的合成；但是每一個 B 細胞只能產生一種抗體，對抗一種抗原決定基。若有一個多價抗原分子，可被宿主生物辨認出四個抗原決定基，則此宿主至少

5、會產生四種 B 細胞，產生四種不同的抗體，分別對抗這四個抗原決定基。已知每一種 B 細胞都只能生產一種抗體，因此若能夠挑出所要的 B 細胞，大量培養後令其產生均質的抗體，就能達成上述目的。 而這種抗體因為是由單一株 B 細胞所生產，也只含有一種抗體，稱之為 單株抗體 (monoclonal antibody, mAb)。此關鍵技術是 1980 年代，單株抗體與傳統抗血清在應用上，有些不一樣的地方：(1) 單株抗體是由已經建立的融合瘤細胞所生產，因此只要細胞株存在，就可以一直生產該抗體，可以視為一種固定的試劑，不像靠動物生產的傳統抗血清，隨著動物個體不同會有變化；(2) 單株抗體因為只含有一種抗

6、體，無法像傳統血清一樣，與抗原產生免疫沈澱，因此雙向免疫擴散也無法產生沈澱線；(3) 基於同樣的理由，加上單株抗體與抗原的結合部位通常只有一處，因此整體的結合力量可能不如傳統抗血清；(4) 但是單株抗體的專一性較好，且可控制所要對抗的抗原決定基位置。近年來也因此流行一種方法，先選擇目標蛋白質上具有較強抗原性的一個片段，大約有十到二十個胺基酸的長度，再以人工方法合成出這條胜汰後，接到無關的巨分子蛋白質 carrier，然後免疫動物產生傳統的抗血清。這種抗血清因為只會對抗一段很短的蛋白質片段，有點類似單株抗體對抗抗原決定基的高度專一性，特稱之為 單專一性抗體 (monospecific Ab)。另

7、外，當基因操作技術發達之後，發展出 噬菌體表現 (phage display) 的方法，期以取代傳統的細胞融合方法，以便得到類似單株抗體的專一性探針。這是利用噬菌體的外殼蛋白基因為架構，插入抗體基因上與抗原結合區的部份 (variable regions 或 domains)，然後利用基因洗牌方式任意修改這段基因，建立一個噬菌體基因庫並由其中篩選，找出可以表現對抗原具有高專一性結合的噬菌體。這種方法相當吸引人，因為可用人為的方法達成在細胞內所進行的免疫確認反應，同時若篩得此一噬菌體，可馬上取出這段具有高專一性結合的基因，經修飾之後應用為人體的免疫治療試劑。酵素連結免疫吸附法( enzyme-l

8、inked immunosorbent assay, ELISA )和放射線免疫分析法( radioimmunoassay, RIA )是依照相同的原理直接測定所結合的抗體(或抗原)的分析方法，唯如何偵測專一性結合所用的方法不同。放射線免疫分析法通常是用於測定血液或組織液中荷爾蒙濃度，而ELISA則常用於檢測病毒，例如測定愛滋病的感染。這兩種方法都必須先純化已知的抗原或抗體或兩者以標準化分析方法。以下我們將介紹較常用於純化抗體的方法，但若須使用純化的抗原，其原理也相同。用RIA偵測抗原，須將專一性的抗體先用放射線標定，最常使用的放射線是碘125 ( 125 I )；用ELISA偵測抗原，則是須

9、以化學的方法將酵素連結到抗體上，而未經標記的成份(抗原)則附著在固體支撐物如多孔塑膠平盤的孔內，它可吸附一定量的任何蛋白質。在非專一性吸附被阻斷的情形下，經標記的抗體會與未經標記的抗原結合，而未結合的抗體及其他蛋白質則被洗掉。在RIA中所結合的抗體可直接由反應盤讀取，數據的收集非常容易而且可以避免放射性的傷害，因此使ELISA成為最常使用的直接結合分析法( direct-binding assay )。經標記的抗免疫球蛋白的抗體也可以用於ELISA，以測定結合未標記抗原盤上的未標記抗體。在這裡，標記過的抗免疫球蛋白抗體做為第二層( second layer )，應用第二層抗體可以加強訊號，因為

10、每一個未標記的第一層抗體至少可以結合兩分子的標記抗體。ELISA也可將未標記的抗體插於平盤內再加入標記的抗原來完成。ELISA另一修正後的方法稱為補捉法( capture )或三明治酵素連結免疫吸附法( sandwich ELISA )【或較常用的為抗原補捉法( antigen-capture assay ) 】，可用於偵測分泌性的產物如細胞激素( cytokines )。此種方法是將專一性的抗體而非抗原結合在平盤內，這些專一性抗體對抗原具有極高的親和性，因此即使最初的混合物中抗原的濃度很低，也能將其集中於平盤表面，再加入另一組能辨認異於固定相的抗體辨認表位( epitope )的標記抗體來偵

11、測所結合的抗原。這些試驗可說明所有血清學檢驗中的兩大重點，首先是至少要有一樣試劑是可以純化並定量偵測的，其次必須將結合標記的試劑使其自未結合的部分中分離出來，如此才可以識別專一性的結合比例。在正常的情況下，分離的方法是將無標記的結合物附著在固體容器上，如此便可將未結合的標記分子洗掉，而只留下標記的結合物。如圖一所示，將無標記的抗原附著在孔的底部，而使標記的抗體與之結合，自結合物中分離出未結合物是抗體檢查法的基本步驟。 (圖一) 酵素連結免疫吸附測定法的原理。為檢測抗原A，將純化的抗原A專一性抗體連接在酵素上，將待測的樣品吸附在塑膠孔盤的底部，而其餘的結合位則用非相關的蛋白質抑制(未顯示在圖中)

12、，在去除非專一性的結合之後加入已標記的抗原A專一性抗體，將未結合的抗體清洗掉，而已結合的抗體則用酵素使之改變顏色進行檢測，此檢測法可利用多孔的塑膠盤進行而用光譜儀判讀。此種方法稍加改變後可進行未知抗原或抗體的檢測。 利用ELISA無法自未知組成的樣品中直接測出抗原或抗體的量，因為須依賴與純化的標記抗原或抗體結合之故。有許多方法可以解這些問題，其中一種是利用如圖二所示之競爭抑制試驗法( competitive inhibition assay )。這種檢查法是利用標記的參考抗原和未知樣品內的特定抗原互相競爭與吸附在塑膠孔內的抗體發生結合。藉由加入不同量未標記的已知抗原來畫出標準曲線，利用此標準曲

13、線與含有未知樣品者比較以測定抗原的含量，只要將適當的抗原附著在塑膠孔中，而後測定樣品抑制標記專一性抗體的結合能力。(圖二) 利用競爭抑制檢測法檢測未知樣品中的抗原。將一定量無標記的抗原附著在盤孔底部，而後加入經過標記的標準抗原與之結合，之後再加入不同劑量無標記的標準抗原或待測樣品，觀察其取代已標記抗原的情形，劃出抑制曲線。利用等量的無標記抗原與經過標記的已知抗原混合，劃出標準曲線，再與所劃出的曲線做比較。圖中的綠線代表缺乏受質的樣品與抗原A抗體反應的區線圖。酵素連結免疫吸附法( enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA )所使用的酵素包括horserad

14、ish peroxidase、 alkaline phosphatase、 lysozyme、 and glucose 6-phosphate dehydrogenase等。這些酵素常利用glutaldehyde或dimaleimide等物質將其連接到抗原或抗體分子上，其特性是化性穩定，可溶於水，組織中含量低，如此方不致於干擾結果。ELISA常被用來偵測CEA (carcinoembryonic antigen)、 steroid hormones、 immunoglobulin、 DNA、 bacteria和virus的抗體等，其靈敏度高( ng / ml range )，操作簡便、試劑穩定

15、、儀器價廉及不須要使用危險性高的放射線物質等優點，使其未來應用範圍日益增加。在ELISA的實驗中，常用的substrate的敏感性由低到高，分別為Colorimetric < Fluorescent < Chemiluminescent。而選擇substrate需要依據enzyme reporter system；以Alkaline phosphatase (AP) 和 horseradish peroxidase (HRP)為例， 為常用於免疫反應的物質；而兩者酵素具有多種的substrate；且本身分子量小以及可以快速反應出訊號的產生，且所需的價格低系統穩定。目前常用於ELIS

16、A的substrate有QuantaBlu 、Fluorogenic、Luminol，其所需的酵素分別為HRP、PNPP、Alkaline phosphatase (AP)。如圖三所示。(圖三)ELISA在臨床診斷學上的應用包括：德國麻疹抗體之測定；CMV、 HSV、 measles、 mumps、 VZV等病毒抗體測定。HIV抗體測定（Rapid ELAVIA，SERODIA-HIV）及C型肝炎病毒抗體測定（C型肝炎病毒亦可用PCR來測定）。運用酵素連結免疫吸附分析法（ELISA）進行檢測之產品，將疑似感染之食物或是食物中毒病人之糞便檢體加以培養，再使用酵素免疫吸收法（ELISA）對菌種進行

17、定性定量檢測，此產品適合衛生單位於檢驗實驗室進行檢測或是確認中毒菌種時使用。食品微生物測試系列，李斯特菌免疫檢驗試劑(Listeria monocytogenes ELISA)、腸炎弧菌免疫檢驗試劑(Vibrio parahaemolyticus ELISA)、仙人掌桿菌免疫檢驗試劑(Bacillus cereus ELISA)。植物病毒診斷試劑；黃化嵌紋、蕪菁嵌紋及胡瓜嵌紋等三種病毒診斷試劑，利用兔子製造出病毒抗血清，分離出來後製成病毒診斷試劑，由診斷試劑顏色顯現的深淺，斷定瓜果病毒強弱。另外細菌的檢驗，萊姆病、鉤端螺旋體感染症也可運用ELISA原理偵測；羊乳中牛乳摻假之快速檢測，自牛乳中分離純化酪蛋白作為抗原，用以免疫兔子及山羊免疫兔子經大量抽血並收集其血清後，以硫酸銨沈澱血清白質，並先後經DEAE-Sephacel陰離子交換管柱純化及連結有山羊酪蛋白之CNBr-activated Sepharose 4B親合性管柱純化出對牛乳酪蛋白具高專一性之抗體。此純化抗體經由間接型酵素連