ELIS精选OT实验方法

1、脾细胞保存方法（一）短期保存技术适用范围：术后1周PRT反应。保存方法：将分离到的细胞用适量含10%20%灭活小牛血清的 RPMI1640培养液稀释重悬。置4C保存较好，可减低细胞代谢活动。要注意不要迅速改 变细胞所处的温度，以免造成细胞“温度”休克。保存 1 管即可。（二）长期冷冻保存技术适用范围：术后2周以后的PRT反应。保存方法：利用液氮深低温（-196C）环境保存细胞，冷冻时的降温速度 和细胞解冻时的升温速度对细胞活力的保存有很大影响。低速离心后，取沉积 细胞用含 10%二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的细胞悬液，分装于冻存管 内（保存 3 管），速即放入降温过渡站中，避免二甲亚砜对细

2、胞的损伤。用两 步降温法，即迅速降温至-80C低温冰箱过夜，或在液氮罐液面以上的一层空 间放置片刻，然后再放入液氮中。如需复苏细胞，则需迅速解冻以恢复细胞的 活力，要求在20s以内完全融化。将冻存管自液氮中取出，立即放入40C温水中，融化后即从水中取出，吸出细胞悬液，加入 10倍的培养液中混匀，继而低 速离心，尽快洗去保护剂，再悬于新培养液中，计数并检查细胞活力，然后置 37 °C培养箱内培养。相关试剂的配制（一）PBS 800ml 蒸馏水中，溶解 8 克 NaCI、2 克 KCI、1.44 克 Na2HPO和 0.24 克KH2PO4用HCI调节PH到7.4，加水定容到1升，高压蒸

3、汽灭菌20分，室 温保存。或：8克Nacl、0.2克KCl、1.44克KH2PO4用HCI调整PH到到7.4，加水定容到 1升，高压蒸汽灭菌 20分，室温保存。或：在 800ml 蒸馏水中溶解8g NaCI、0.2g KCI、1.44g Na2HPO4和 0.24g KH2PO4,用 HCI 调溶液的 pH值至7.4 加水定容至 1L。（二）PHA 10 卩 g/mL （终浓度）。（三）丝裂霉素（mitomycin c,MMC : 50 口 g/mL,for 20 minutes,and then three washes in PBS 。（四）PBLs： 300000 个细胞加入含 10%F

4、CS勺 100 口 lRPMI，终体积 200 口 l。 ELISPOT操作步骤（一）ELISPOT式验基本步骤 将适量捕获性抗体预先包被于 96孔ELISPOT板上 ,用胶带封板并在4C孵 育过夜。将板用PBS洗3遍，再用含体积比10%胎牛血清（FCS）的培养基封闭，室温 下孵育至少1h0 FCS可以封闭所包被抗体的FC受体以降低非特异性反应。 将细胞样品，如外周血单核细胞（PBMC）,用含10%FC的培养基稀释，分装 于ELISPOT板孔中，再加入特异的刺激物，阴性对照孔中只加入培养基，阳性对 照孔加入植物血凝素（PHA,10卩g/mL）,37 C ,体积比为5 % CO2培养24h。 用

5、含体积比0.01%Tween2啲PBS洗6次，以弃去细胞，加入生物素化抗细胞 因子的检测抗体 , 孵育3 h0 再洗6次后，加入AKP或HR标记的链亲和素，室温孵育23ho 用PBSTween2再洗5次，加入BCIP/NBT底物，室温下显色，待出现紫色（AKP 和底物的产物）或红色（HRF和底物的产物）斑点时，即可用立体解剖显微镜或计 算机辅助成像分析系统计算斑点数 , 并用斑点形成单位 （ sfu/ L 百万加入细胞 ）记录结果。每一个斑点代表一个特异分泌 CK的细胞。若预先包被抗原，则可用于ASC测定,这时,每一个斑点代表一个分泌特异抗体的细胞。细胞计数细胞数就是：四大格总数 /4*10

6、4/ml ，再乘以稀释倍数。 ELISPOT操作注意事项（一）背景颜色过强可通过下列方法解决可增加12次PBSTween-20清洗；显色反应前用PBS洗板，因为Wash Buffer的Tween-20可导致背景过强； 适当延长风干时间；实验前洗细胞要完全。（二）实验后，微板要置 37 度以下，否则会损坏微板。设计好试验 , 把每个孔 要加入的内容做成卡片。（三）次日，倾倒包被液，用 PBS 洗涤 3 次。最后一次，在灭菌的吸水纸上抠 干。（四）整个实验设置1组正对照（PHA刺激），每一个细胞样品（同一个捐献者 或实验动物） 要设 1 组负对照 （不加刺激物） ，整块板还要加 1 组背景对照 （

7、不 含细胞，只加培养基和所有检测试剂），均设复孔。这步加完所有样品之后，放入二氧化碳培养箱，37C培养18-24h，注意：碰撞会引起细胞移位，造成斑 点模糊，拖尾。在整个培养过程中应避免移动、碰撞培养板，并尽量减少开关 培养箱的次数。（五） protocol（一）用coati ng buffer 稀释捕捉抗体，每孔100 口 l稀释抗体，盖上板盖，4度过夜。（二）甩干，每孔 200 口 IBIocking Solution洗 1 次，每孔 200 口 IBIockingSolution ，盖板，室温培养 2h。（三）弃去 Blocking Solution ，用完全 1640 （RPMI164

8、0 FBS 青霉素和 L 谷氨酰胺）稀释丝裂原或抗原，100 口 I加入每孔。（四）1X 105cells/ml 2X 106cells/ml 细胞悬液每孔 100 口 I，加盖，5 % CO2 湿盒培养（时间224h不等）。（五）吸出细胞悬液，去离子水洗 35分钟，共2次。每孔200卩IWash BufferI，3次，弃液，加稀释检测抗体（Dilution Buffer ），每孔100卩I，加盖室 温培养 2h。（六）弃去检测抗体，每孔200 口 IWash Buffer I ，3次，每次12分钟。（七）Dilution Buffer稀释酶聚合物（Streptavidin-HRP ），每孔

9、100 口 I 稀释酶。加盖，室温培养 1h。（八）弃去酶聚合物，每孔200 口 IWash Buffer I ，4次，每次12分钟。每孔 200 口 IWash Buffer II ， 2 次。每孔 100 口 I 显色 Substrate Solution ，观测 反应 5 60 分钟，不要反应显色过度，以免背景色过强。去离子水洗终止显色 反应。（九）室温 2h 风干或过夜，去除底部塑料托盘将有助于风干，分析前置塑料密 闭袋内避光。相关试剂的配制（一） Coati ng Buffer : 1 X PBS 800ml 蒸馏水中，溶解 8 克 NaCI、0.2 克 KCI、1.44克Na2HP

10、O4和0.24克KH2PO4用HCI调节PH到7.2，加水定容到1 升, 高压蒸汽灭菌 20 分，室温保存二） Blocking Solution ：细胞完全培养基（ RPMI1640）， 10 FBS、 1青链酶素和 L谷氨酰胺（Gibco-BRL No. 10378-016 ）。（三）Wash Buffer I : 1 x PBS包含0.05% Tween-20 （0.5 ml Tween-20 per 1 LPBS）。（四）Wash Buffer II : 1xPBS。（五）Dilution Buffer : 1 x PBS包含 10% FBS（六）Substrate Solution : AEC（ 3-氨基-9-乙基咔唑，Sigma A-5754）储存 溶液：100mgAECn 10ml DMF（N,N二甲基甲酰胺，sigma D-4551）,储存在玻璃瓶内；0.1M醋酸盐溶液：将0.2M的（冰）醋酸148ml加入352ml0.2M醋酸钠溶液中， 加入水调整至1 升, PH5.0；333.3卩l of AEC储存溶液加入10ml0.1M醋酸溶液中，0.45卩m filter 滤过，加入5卩l H2O2 （30%），即刻使用。试剂保存（1） 如果短时间内不用，溶解的检测抗体应分装和保存于一20C，在这种条件下，