基因工程制药9,10,11,12,13节

1、基因工程制药基因工程制药9,10,11,12,139,10,11,12,13节节一、概一、概 述述 高密度发酵：培养液中工程菌的菌体浓度在高密度发酵：培养液中工程菌的菌体浓度在50g DCW/L（细胞干重（细胞干重/L）以上，最高）以上，最高200g DCW/L 外源基因表达产量与单位体积产量正相关；外源基因表达产量与单位体积产量正相关； 单位体积产量与细胞浓度和单个细胞平均表达产量正相单位体积产量与细胞浓度和单个细胞平均表达产量正相关。关。 高密度发酵是在单个细胞平均表达产量不变的前提下，高密度发酵是在单个细胞平均表达产量不变的前提下，通过单位体积的菌体数量的倍增，实现总表达量的提高。通过单

2、位体积的菌体数量的倍增，实现总表达量的提高。高密度发酵特点高密度发酵特点 菌体高密度，总表达量高菌体高密度，总表达量高 生物反应器体积小生物反应器体积小 单位体积生产能力高单位体积生产能力高 生产周期短，分离成本小生产周期短，分离成本小一、影响高密度发酵的因素一、影响高密度发酵的因素 1.培养基：培养基：C源、源、N源种类和含量；源种类和含量；C:N含量比值；微量元素；含量比值；微量元素；无机盐（磷影响表达质粒的复制速率）无机盐（磷影响表达质粒的复制速率） 2.溶氧浓度：溶氧浓度：空气分离系统提高氧分压；透明颤菌血红蛋白基空气分离系统提高氧分压；透明颤菌血红蛋白基因克隆到菌体中，提高氧传质能力

3、；菌体与小球藻混合培养，藻因克隆到菌体中，提高氧传质能力；菌体与小球藻混合培养，藻细胞光合作用产氧供菌体呼吸。细胞光合作用产氧供菌体呼吸。 值：值：大肠杆菌产酸、大肠杆菌产酸、CO2必须加碱调节必须加碱调节pH值值 4.温度：温度：控制菌体生长，温控诱导表达（诱导时机和持续时间，控制菌体生长，温控诱导表达（诱导时机和持续时间，对数生长期，对数生长期，2min） 5.代谢副产物：代谢副产物： C源物质供应超过三羧酸循环或电子传递链能源物质供应超过三羧酸循环或电子传递链能力，产生乙酸，抑制菌体生长和蛋白表达。采取流加补料法，或力，产生乙酸，抑制菌体生长和蛋白表达。采取流加补料法，或加入甘氨酸、甲硫

4、氨酸抑制乙酸生成。加入甘氨酸、甲硫氨酸抑制乙酸生成。二、实现高密度发酵的方法二、实现高密度发酵的方法 1.发酵条件的改进发酵条件的改进 （1）培养基的选择：）培养基的选择：6g/L的甘油作碳源（缩短工程菌的利用的甘油作碳源（缩短工程菌的利用时间），各组分浓度较普通提高时间），各组分浓度较普通提高23倍。倍。 （2）建立流加式培养方式：）建立流加式培养方式：营养液（补料）分批维持菌体营养液（补料）分批维持菌体高生长速率时添加。补料分批发酵包括：反馈补料（恒速补料、高生长速率时添加。补料分批发酵包括：反馈补料（恒速补料、变速补料、指数补料）；非反馈补料（恒溶氧法、变速补料、指数补料）；非反馈补料（

5、恒溶氧法、pH法、菌体浓法、菌体浓度反馈法）。度反馈法）。 （3）提高供氧能力：）提高供氧能力：加压、纯氧、加压、纯氧、H2O2、提高氧传质能力等。、提高氧传质能力等。 2.构建产乙酸能力低的工程化宿主菌构建产乙酸能力低的工程化宿主菌（1）阻断乙酸生产的主要途径：）阻断乙酸生产的主要途径：用基因敲除技术或基因突变技术使用基因敲除技术或基因突变技术使大肠杆菌的磷酸转乙酰酶（大肠杆菌的磷酸转乙酰酶（PTA）基因）基因pta1和乙酸激酶和乙酸激酶(ACK)基因基因acka失失活，使丙酮酸到乙酸的合成途径被中断。活，使丙酮酸到乙酸的合成途径被中断。（2）对碳代谢流进行分流：）对碳代谢流进行分流：丙酮酸

6、脱羧酶和乙醇脱氢酶丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶可将丙酮酸可将丙酮酸转成乙醇，毒性小于乙酸。转成乙醇，毒性小于乙酸。（3）限制进入糖酵解途径的碳代谢流：）限制进入糖酵解途径的碳代谢流：用基因敲除技术将磷酸转移用基因敲除技术将磷酸转移酶系统（酶系统（PST）酶）酶的的ptsG基因破坏，降低葡萄糖的摄取速率。基因破坏，降低葡萄糖的摄取速率。（4）引入血红蛋白基因：透明颤菌血红蛋白基因）引入血红蛋白基因：透明颤菌血红蛋白基因vgb导入大肠杆导入大肠杆菌，菌，提高氧传质能力，耐缺氧环境。提高氧传质能力，耐缺氧环境。 3.构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 rpoH基因编码大

7、肠杆菌基因编码大肠杆菌RNA聚合酶的聚合酶的r32亚基，亚基， r32亚亚基对多种蛋白水解酶的活力正调控。基对多种蛋白水解酶的活力正调控。 构建构建rpoH基因缺陷的突变株，降低蛋白水解酶的活力。基因缺陷的突变株，降低蛋白水解酶的活力。p 基因工程药物都是多肽或蛋白质，其特点为：基因工程药物都是多肽或蛋白质，其特点为： 表达产物在初始物料中含量较低；表达产物在初始物料中含量较低； 含有大量细胞及代谢产物、残留培养基、无机盐；含有大量细胞及代谢产物、残留培养基、无机盐； 表达产物稳定性差，易失活、变性；表达产物稳定性差，易失活、变性； 表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异；表达产物的种类繁多、

8、结构不一、活性各异； 应用广，对其质量纯度要求高、无菌、无热源。应用广，对其质量纯度要求高、无菌、无热源。一、建立分离纯化工艺的根据（各种因素）一、建立分离纯化工艺的根据（各种因素） 含目的产物的起始物料的特点（上游过程的各种因素对分离、纯含目的产物的起始物料的特点（上游过程的各种因素对分离、纯化工艺的影响）包括：化工艺的影响）包括： 菌种的类型及其代谢特性、产物、副产物。原材料和培养基菌种的类型及其代谢特性、产物、副产物。原材料和培养基的来源及其质量是否稳定。生产工艺和条件。的来源及其质量是否稳定。生产工艺和条件。 初始物料的理初始物料的理化性质、生物学性质。化性质、生物学性质。 物料中杂质

9、的种类和性质。物料中杂质的种类和性质。目的产物特性。目的产物特性。产品质量的要求产品质量的要求二二 、分离纯化的基本过程、分离纯化的基本过程 发酵液发酵液 细胞分离细胞分离胞内产物胞内产物 胞外产物胞外产物 细胞破碎细胞破碎 固液分离固液分离 浓缩浓缩 初步分离初步分离 高度纯化高度纯化 制剂制剂 产品产品包含体包含体 细胞碎片分离细胞碎片分离 变性变性 复性复性三三. .细胞破碎细胞破碎1.1.物理破碎法物理破碎法 （1 1）高压匀浆法）高压匀浆法 （2 2）高速珠磨法）高速珠磨法 （3 3）超声破碎法）超声破碎法 （4 4）高压挤压法）高压挤压法2.2.化学破碎法化学破碎法 （1 1）渗透

10、冲击）渗透冲击 （2 2）增溶法）增溶法 （3 3）脂溶法）脂溶法3.3.生物破碎法：酶溶法生物破碎法：酶溶法四四. .固液分离固液分离1.1.离心沉淀法离心沉淀法2.2.膜过滤法膜过滤法3.3.双水相萃取双水相萃取五、重组蛋白的分离纯化技术五、重组蛋白的分离纯化技术技术条件温和能保持产物生物活性。技术条件温和能保持产物生物活性。选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达到较高的纯化倍数。达到较高的纯化倍数。收率要高。收率要高。两个技术间能直接衔接，不需要对物料加以处理。两个技术间能直接衔接，不需要对物料加以处理。纯化过程要快，满足高

11、生产率的要求。纯化过程要快，满足高生产率的要求。 目的产物的分离纯化目的产物的分离纯化 蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。物学特性来决定。 产产 物物 特特 性性 作作 用用 等电点等电点 决定离子交换种类及条件决定离子交换种类及条件相对分子量相对分子量 选择不同孔径的介质选择不同孔径的介质疏水性疏水性 与疏水、反相介质结合的程度与疏水、反相介质结合的程度生物特异性生物特异性 决定亲和配基决定亲和配基溶解性溶解性 决定分离体系及蛋白浓度决定分离体系及蛋白浓度稳定性稳定性 决定工艺采用温度及流程时间决定工艺采用温度及流

12、程时间 产物的特性在分离纯化中的作用产物的特性在分离纯化中的作用分离纯化的方法：色谱分离方法分离纯化的方法：色谱分离方法 离子交换层析离子交换层析（ ion exchange chromatography ，IEC）p 离子交换层析的基本原理是通过带电的溶质分子与离子离子交换层析的基本原理是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。p 它具有分辨率高容量大操作容易，该法已成为多肽蛋白它具有分辨率高容量大操作容易，该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。质核酸分离纯化的重要方法。 反相色谱（反相色谱（rever

13、sed phase chromatography，RPC）和）和 疏水色谱（疏水色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）p 反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。纯化的。p 反相色谱是利用溶质分子中非极性基团与非极性固定相反相色谱是利用溶质分子中非极性基团与非极性固定相之间相互作用力的大小以及溶质分子中极性基团与流动之间相互作用力的大小以及溶质分子中极性基团与流动相中极性分子之间在相反方向作用力的大小差异进行分相中极性分子之间在相反方向作用力的大小差异进行分离的。离的。p 常用

14、固定相为硅胶烷基键合相。常用固定相为硅胶烷基键合相。p 流动相为低离子强度的酸性水溶液，加入能与水互溶的流动相为低离子强度的酸性水溶液，加入能与水互溶的乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂。乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂。p 由于固定相骨架疏水性强，吸附的蛋白质需用有机溶剂由于固定相骨架疏水性强，吸附的蛋白质需用有机溶剂才能洗脱下来。才能洗脱下来。p 疏水层析的原理与反相色谱的原理相似，主要是利用蛋疏水层析的原理与反相色谱的原理相似，主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互作用力增强。相互作用，无机盐的存在

15、能使相互作用力增强。p 固定相介质表面的疏水性比反相色谱介质表面的疏水性固定相介质表面的疏水性比反相色谱介质表面的疏水性弱。为有机聚合物键合相或大孔硅胶键合相。弱。为有机聚合物键合相或大孔硅胶键合相。p 流动相为流动相为pH68盐水溶液。盐水溶液。p 高盐浓度时，蛋白质分子中疏水性部分与介质的疏水基高盐浓度时，蛋白质分子中疏水性部分与介质的疏水基团产生疏水性作用而被吸附；团产生疏水性作用而被吸附；p 盐浓度降低时，蛋白质疏水性作用减弱，目的蛋白质被盐浓度降低时，蛋白质疏水性作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗脱时间越长。逐步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗脱时间越长。p 与反

16、相色谱相比，疏水层析回收率较高，蛋白质变性可与反相色谱相比，疏水层析回收率较高，蛋白质变性可能性小。能性小。亲和层析（亲和层析（affinity chromatography，AC）p 亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。p 配基：在亲和层析中起可逆性结合的特异性物质。配基：在亲和层析中起可逆性结合的特异性物质。p 载体：与配基结合的支撑物。载体：与配基结合的支撑物。p 亲和层析可分三步：亲和层析可分三步：

17、配基固定化配基固定化 吸附目的物吸附目的物 样品解吸样品解吸凝胶过滤层析凝胶过滤层析p 凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。p 根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子的动力学体积的大小差异，根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子的动力学体积的大小差异，可以利用凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。可以利用凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。p 主要

18、应用两个方面：主要应用两个方面： 脱盐和更换缓冲液脱盐和更换缓冲液 蛋白质分子的分级分离。蛋白质分子的分级分离。在产品的形成阶段前用于除去产物的多聚体及降解产物。在产品的形成阶段前用于除去产物的多聚体及降解产物。六、非蛋白质类杂质的去除六、非蛋白质类杂质的去除p DNA的去除：的去除：DNA在以上呈阴离子，蛋白质的在以上呈阴离子，蛋白质的pI在在以上以上,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性，可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸不吸附。附。p 亲和层析和疏水层析也有效。亲和层析和疏水层析也有效。

19、 热原质的去除：热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素热原质的去除：热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖（脂多糖G菌细胞壁成分）去除困难。分子量小的多菌细胞壁成分）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。层析法。 病毒的去除：层析或过滤可将病毒去除病毒的去除：层析或过滤可将病毒去除,紫外线照射紫外线照射使病毒失活。使病毒失活。 七、选择分离纯化方法的依据七、选择分离纯化方法的依据 根据产物表达形式来选择根据产物表达形

20、式来选择p 分泌型表达产物的发酵液体积很大但浓度较低，纯化前分泌型表达产物的发酵液体积很大但浓度较低，纯化前必须浓缩，可用沉淀和超滤法。必须浓缩，可用沉淀和超滤法。p 可溶性表达产物破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法，可溶性表达产物破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法，或离子交换层析。或离子交换层析。p 产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达的一种形式的一种形式,它可以避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋它可以避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白类杂质白类杂质,在一定程度上有利于在一定程度上有利于分离纯化。分离纯化。p 为了获得周质蛋白，经低浓度溶菌酶

21、处理后为了获得周质蛋白，经低浓度溶菌酶处理后, ,可采用渗可采用渗透压休克的方法来获得。透压休克的方法来获得。 根据分离单元之间的衔接选择根据分离单元之间的衔接选择p 应选择不同机制的分离单元组成一套分离工艺，尽早采应选择不同机制的分离单元组成一套分离工艺，尽早采用高效的分离手段。用高效的分离手段。p 先将最多的杂质去除，将费用最高、最费时的分离单元先将最多的杂质去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段。放在最后阶段。p 即通常先运用非特异、低分辨的操作单元（如沉淀超滤即通常先运用非特异、低分辨的操作单元（如沉淀超滤和吸附等），以尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去和吸附等），以尽快缩小样

22、品体积，提高产物浓度，去除最主要杂质（包括非蛋白类杂质）。除最主要杂质（包括非蛋白类杂质）。p 随后采用高分辨率的操作单元（离子交换层析和亲和层随后采用高分辨率的操作单元（离子交换层析和亲和层析）凝胶过滤放在最后，这样可以提高分离效果。析）凝胶过滤放在最后，这样可以提高分离效果。p 层析分离次序的选择同样重要，合理的组合能提高分辨层析分离次序的选择同样重要，合理的组合能提高分辨效率，并有利于各步骤间的过渡。如离子交换层析、亲效率，并有利于各步骤间的过渡。如离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤色谱。和层析、凝胶过滤色谱。根据分离纯化工艺的要求来选择根据分离纯化工艺的要求来选择分离纯化工艺应遵循以下原

23、则：分离纯化工艺应遵循以下原则： 具有良好的稳定性和重复性具有良好的稳定性和重复性 尽可能减少组成工艺的步骤尽可能减少组成工艺的步骤 各技术步骤间要相互适应和协调各技术步骤间要相互适应和协调 工艺过程中尽可能少用试剂工艺过程中尽可能少用试剂 工艺所用时间要短工艺所用时间要短 工艺和技术必须收率高、易操作、能耗低工艺和技术必须收率高、易操作、能耗低 具有较高的安全性具有较高的安全性第十一节第十一节 变性蛋白的复性变性蛋白的复性 一、包含体形成的原因：一、包含体形成的原因： 在高水平表达时，新生肽链的聚集速率超过蛋白正确折在高水平表达时，新生肽链的聚集速率超过蛋白正确折叠的速率就形成包含体；重组蛋

24、白在大肠杆菌中表达时，叠的速率就形成包含体；重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏一些折叠酶和分子伴侣形成包含体。缺乏一些折叠酶和分子伴侣形成包含体。二、包含体的分离和溶解二、包含体的分离和溶解 1.包含体的分离：重组菌破碎、洗涤，蔗糖密度梯度离包含体的分离：重组菌破碎、洗涤，蔗糖密度梯度离心法纯化心法纯化 2.包含体的溶解：用强变性剂（盐酸胍、脲）或去垢剂包含体的溶解：用强变性剂（盐酸胍、脲）或去垢剂（SDS）三、包含体蛋白复性方法三、包含体蛋白复性方法 1.稀释、透析复性法稀释、透析复性法 2.含二硫键的蛋白的复性含二硫键的蛋白的复性 3.封闭蛋白的疏水簇促进复性封闭蛋白的疏水簇促进复性 4.凝

25、胶过滤层析复性凝胶过滤层析复性 5.小分子添加剂促进的复性小分子添加剂促进的复性 6.折叠酶或分子伴侣促进的复性折叠酶或分子伴侣促进的复性 7.人工分子伴侣促进的复性人工分子伴侣促进的复性第十二节第十二节 基因工程药物的质量控制基因工程药物的质量控制一、医药生物技术产品质量保证的一般要一、医药生物技术产品质量保证的一般要点点 1.1.产品安全性评价产品安全性评价 2.2.产品本身的结构产品本身的结构 3.3.严格控制条件严格控制条件二、二、 原材料的质量控制原材料的质量控制p 确保编码药品的确保编码药品的DNA序列的正确性序列的正确性p 重组微生物来自单一克隆重组微生物来自单一克隆p 所用质粒

26、纯而稳定所用质粒纯而稳定p 保证产品质量的安全性和一致性。保证产品质量的安全性和一致性。 根据质量控制要求应了解以下特性：根据质量控制要求应了解以下特性：目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶酶切目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶酶切图谱和核苷酸序列予以确证；图谱和核苷酸序列予以确证；表达载体的名称、结构、遗传特性及各组成部分（如表达载体的名称、结构、遗传特性及各组成部分（如复制子、启动子）的来源与功能，构建中所用位点的酶复制子、启动子）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标记物；切图谱，抗生素抗性标记物； 宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性；宿主

27、细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性； 须阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞与载体结合须阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；后的遗传稳定性； 提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，详细提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中启动与控制克隆基因在宿主细胞中表达的方法叙述在生产过程中启动与控制克隆基因在宿主细胞中表达的方法及水平。及水平。三、培养过程的质量控制三、培养过程的质量控制p 在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定；p 在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳

28、定，始终无突在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；变；p 在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；p 始终能排除外源微生物污染。始终能排除外源微生物污染。p 生产基因工程产品应有种子批系统，并证明种子批不含有致癌因生产基因工程产品应有种子批系统，并证明种子批不含有致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库。生产用工作细胞库。p 原始种子批须确证克隆基因原始种子批须确证克隆基因DNADNA序列，详细叙述种子批来源、方式、序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使

29、用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。p 培养周期结束时，应监测宿主细胞培养周期结束时，应监测宿主细胞- -载体系统的特性，载体系统的特性，例如：质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度，含例如：质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度，含插入基因载体的酶切图谱等。插入基因载体的酶切图谱等。 四、纯化工艺过程的质量控制四、纯化工艺过程的质量控制p 产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；子批间保持一致性；p 外源蛋白质、外源蛋白质、DNA与热源物质控制在规定限度以

30、下。与热源物质控制在规定限度以下。p 在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测方法。检测方法。五、目标产品的质量控制五、目标产品的质量控制p 基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求: 产品的鉴定、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。产品的鉴定、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。 需要用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分需要用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多学科的理

31、论与技术建立鉴定方法。子生物学等多学科的理论与技术建立鉴定方法。1.1.生物学活性测定生物学活性测定p 需通过动物体内试验和体外细胞培养进行效价测定。需通过动物体内试验和体外细胞培养进行效价测定。p 国际单位国际单位p 蛋白质的比活性：效价蛋白质的比活性：效价/,不仅是含量指标也是纯不仅是含量指标也是纯度指标。度指标。2. 产品的理化性质鉴定产品的理化性质鉴定 常用的鉴定方法常用的鉴定方法:电泳方法电泳方法: SDS-PAGE、等电聚焦、免疫电泳、等电聚焦、免疫电泳免疫学方法免疫学方法: 放射免疫放射免疫(RIA)、酶联免疫、酶联免疫(ELISA) 受体结合试验受体结合试验高效液相

32、色谱高效液相色谱(HPLC)、肽图分析法、末端序列分、肽图分析法、末端序列分 析、析、圆二色谱、核磁共振圆二色谱、核磁共振 （1）非特异性鉴别 （2）特异性鉴别 （3）重组蛋白质浓度测定和相对分子量的测定：重组蛋白质浓度测定和相对分子量的测定： 蛋白质浓度测定方法有蛋白质浓度测定方法有: :福林福林- -酚法、双缩脲法酚法、双缩脲法 蛋白相对分子量的测定蛋白相对分子量的测定: :凝胶过滤法、凝胶过滤法、SDS-PAGESDS-PAGE法法 （4）等电点测定（5）肽图分析）肽图分析p 肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质，对生成的肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质，对生成的肽段进行分离分析

33、。肽段进行分离分析。p 它是检测蛋白质一级结构最有效的方法，该技术灵敏、它是检测蛋白质一级结构最有效的方法，该技术灵敏、高效是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行评高效是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。价和验证的首选方法。p 常用常用HPLC、毛细管电泳。、毛细管电泳。（6）氨基酸成分分析：）氨基酸成分分析：50个氨基酸较理想个氨基酸较理想（7）部分氨基酸序列分析：）部分氨基酸序列分析：N端端15个氨基酸可作为重组个氨基酸可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。蛋白质和多肽的重要鉴定指标。（8） 蛋白质二硫键分析：对氯汞苯甲酸法蛋白质二硫键分析：对氯汞苯甲酸法(

34、PMCB)、5，5-二硫基双二硫基双-2-硝基苯甲酸法（硝基苯甲酸法（DTNB）等）等3. 3. 蛋白质纯度分析蛋白质纯度分析 蛋白质含量测定蛋白质含量测定( (纯度分析纯度分析) ) SDS-PAGE SDS-PAGE、等电聚焦、等电聚焦(IEF)(IEF)、各种、各种HPLCHPLC、毛细管电泳（、毛细管电泳（CECE）4. 4. 蛋白质含量测定蛋白质含量测定 Folin-Folin-酚试剂法、染色法（酚试剂法、染色法（BradfordBradford法）、双缩脲法、法）、双缩脲法、凯氏定氮法、紫外吸收法、凯氏定氮法、紫外吸收法、HPLCHPLC法法5. 杂质检测杂质检测 蛋白类杂质：残留

35、宿主细胞蛋白蛋白类杂质：残留宿主细胞蛋白 采用免疫分析的方法采用免疫分析的方法 非蛋白类杂质：病毒、细菌等微生物、热原、内毒素、非蛋白类杂质：病毒、细菌等微生物、热原、内毒素、致敏源及致敏源及DNA。基因工程产物常见杂质和污染物及其基因工程产物常见杂质和污染物及其检测方法检测方法杂质和污染物杂质和污染物 检检 测测 方方 法法内毒素内毒素 鲎试剂、家兔热原法鲎试剂、家兔热原法宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白 免疫分析、免疫分析、SDS-PAGESDS-PAGE、CECE其它蛋白杂质其它蛋白杂质 免疫分析、免疫分析、SDS-PAGESDS-PAGE、HPLCHPLC、CECE残余残余DNA DNADNA

36、 DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合杂交、紫外光谱、蛋白结合蛋白变异蛋白变异 肽谱、肽谱、HPLCHPLC、 IEFIEF、 CECE甲酰蛋氨酸甲酰蛋氨酸 肽谱、肽谱、HPLCHPLC、 IEFIEF、 CECE蛋氨酸氧化蛋氨酸氧化 肽谱、肽谱、HPLCHPLC、 质谱、氨基酸分析质谱、氨基酸分析产物变性或聚和脱氨基产物变性或聚和脱氨基 SDS-PAGESDS-PAGE、IEFIEF、HPLCHPLC、CECE、质谱、凝胶过滤、质谱、凝胶过滤杂质和污染物杂质和污染物 检检 测测 方方 法法单克隆抗体单克隆抗体 SDS-PAGESDS-PAGE、免疫分析、免疫分析氨基酸取代氨基酸取代 氨基酸分析、肽

37、谱、质氨基酸分析、肽谱、质 谱、谱、CECE污染物微生物微生物 微生物学检查微生物学检查支原体支原体 微生物学检查微生物学检查病毒病毒 微生物学检查微生物学检查基因工程产物常见杂质和污染物及其检测方法基因工程产物常见杂质和污染物及其检测方法6.6.稳定性考查稳定性考查 是药品贮藏条件和使用期限的主要依据。是药品贮藏条件和使用期限的主要依据。7.7.产品一致性的保证产品一致性的保证六、产品的保存六、产品的保存液态保存液态保存低温保存低温保存在稳定在稳定pH条件下保存条件下保存高浓度保存高浓度保存加保护剂保存加保护剂保存固态保存：冷冻干燥固态保存：冷冻干燥（预冻、升华、解吸干燥去除吸附水）（预冻、升华、解吸干燥去除吸附水）第十三节第十三节基因工程药物制造实例基因工程药物制造实例p 干扰素（干扰素（interferoninterferon，IFNIFN）是人体细胞分泌的一种活）是人体细胞