生物制药技术-第四章-抗体制药

1、生物制药技术-第四章-抗体制药 因此，抗体是指能与相应抗原特异性综合的具有免疫功能的球蛋白。它是机体免疫系统受 抗原物质刺激后，B淋巴细胞被活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。20 世纪60年代初期.发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。患者血清中也出现 同抗体分子结构类似的球蛋白。因此，将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为 免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。显然，Ig是化学结构上的概念，而抗体是生物学功能上的概 念。也就是说，所有抗体均是Ig，但并非所有Ig分子都具有抗体活性。由于病原微生物是含有 多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗

2、体制剂也是多种抗体的混合物.故称多克隆抗体， 即针 对多种抗原决定簇的抗体。这些抗体制剂在应用过程中经常发生非特异性交叉反应而出现假阳 性结果，必须经多次吸收试验才能得到所谓的精制单价血清，用于临床病原学诊断，如痢疾杆菌 属诊断血清和沙门氏菌属诊断血清等。虽然称为精制单价血清，但仍然难免出现假阳性结果;而且其产量很低.很难满足临床治疗和诊断上的需要。 1975年Kohler和Milstein等人首次利用B 淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体( monoclonal antibody，McAb)。他们将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释 法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一

3、的单克隆细胞系.此细胞系能产生结构和特异性完全相同的高 纯度抗体。这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的，故称为单 克隆抗体(图4-1)。单克隆抗体具有高度特异性、均一性，有稳定来源可大量生产等特点，为抗体 的制备和应用提供了全新的手段.促进了基础医学和临床医学等众多学科的发展。单克隆抗体作为抗体制剂，在临床实践中，主要用于疾病的诊断和治疗两个方面。如利用单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原辅助临床诊断，或用同位素标记单克隆抗体进行肿瘤显像做免疫定位诊断。单克隆抗体制剂也用于临床治疗，如针对T淋巴细胞共有的分化抗原CD的单克隆抗体，因其对器官移植排斥反应有显著的抑制效

4、果，用作免疫抑制剂己在美国批准上市。以单克隆抗体作为载体的药物可对肿瘤进行定向治疗。但是，临床应用的实践证明，免疫导向疗法并没有成功，其障碍有:单克隆抗体均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody， HAMA)，加速了排斥反应，在人体内半衰期只有56 h，难以维持有效药物作用靶组织时间。完整的抗体分子，即Ig的相对子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。基于上述原因，需从两个方面对单克隆抗体加以改造.降低单克隆抗体的免疫原性。降低单克隆抗体的相对分子质量。可以利用基因工程技术制备出基因工程抗体，即可达到上述两个目的。从198

5、4年报道人鼠嵌合抗体以来，已制备出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等诸多类型，基本上己消除了单克隆抗体的鼠源性(免疫原性)，相对分子质量只有完整抗体分子的1/3 1/80，原来鼠源性单克隆抗体的诸多生物学活性业已消失，如激活补体、促进吞噬功能(免疫调理、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等均消失殆尽，只保留问抗原特异性结合的活性，即仅应用其导向作用，制备导向药物用于肿瘤治疗。短短的几年研究使这个领域得以迅速发展，目前已成为抗体应用研究的热点。第二节单克隆抗体及真制备第二节单克隆抗体及真制备制备单克隆抗体的一般流程如图制备单克隆抗体的一般流程如图4-24-2所示，有下述各步骤操作。所示，有下

6、述各步骤操作。 一、抗原与动物免疫一、抗原与动物免疫制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。有 的抗原可用化学方法合成.如精制的地高辛。但在多数情况F抗原物质只能得到部分纯化，甚至 是极不纯的混合物，如部分纯化的干扰素。再通过克隆化选出最适当的单克隆抗体。在制备恶 性肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体时，情况更为复杂，需用整个肿瘤细胞作为免疫原，经过筛选、克隆化，制备出仅存在f肿瘤细胞而不存在于正常细胞上的表团标志分子的单克隆抗体。因免疫功物品系和骨髓瘤细胞在种系发生I二距离越远，产生的杂交瘤越不稳定，故一般采用勺 骨髓瘤供体问一品系的动物进行免疫。目前常用的骨

7、髓瘤细胞系多来自BALBc小鼠和Lou大 鼠，因此免疫功物也多采用相应的品系，最常用的也是BALB/c小鼠。在选择动物时应苦虑到动J物 品系的免疫应答基因对抗原免疫应答的影响。如果BALB/c小鼠对所用抗原不能产生良好的 免疫应答时，应改用其他品系小鼠与大鼠。常用的骨髓瘤细胞系及其来源如表4-1 所示。免疫方法分为体内免疫法和体外免疫法。体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用812周龄的雌性鼠。颗粒性抗原(如细菌、细胞抗原)的免疫原性强，可不加佐剂，直 接注入腹腔10个细胞进行初次免疫，间隙13周，再追加免疫12次。可溶性抗原则按每只 小鼠10 100g抗原与弗氏完全佐剂等量混合

8、后腹腔内注射，进行初次免疫，间隔24周，再 用不加佐剂的原抗原追加免疫12次。一般在采集牌细胞前3日由静脉注射最后一次抗原，其 目的是使对应的B淋巴细胞克隆受到可靠的最大限度的剌激，使其迅速地增殖分裂，因为细胞 融合后增殖最好的细胞是迅速分裂的细胞。在免疫后第二天淋巴细胞的增殖率最高，由静脉注 射就是为了提高抗原浓度，刺激更多的B细胞。近来有人主张采用脾内免疫法，即在麻醉条件 下应接把0. 10. 2 ml的抗原注入脾脏进行免疫。脾内免疫法可提高小鼠对抗原的免疫反应 性，节省抗原用茧，细胞抗原只需10个左右，可溶性抗原只需10g左右。但多数人认为脾内 免疫属初次免疫应答，产生IgM类抗体屑多，

9、故主张在常规免疫的基础上用脾内免疫法做追加 免疫为佳。体外免疫法则在不能采用体内免疫法的情况下，如制备人源性单克隆抗体，或者抗原 的免疫原牲极弱且能引起免疫抑制时使用。体外免疫法的优点很多，所以抗原量少，一般只需几 个微克，免疫期短，仅45 d，于扰因素少，已成功的制备出针对多种抗尿的单克隆抗体，但融合 后产生的杂交瘤细胞株不够稳定。其基本方法是用48周龄BALBc小鼠的脾脏制成单个细 胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达O. 55giml，在5%CO2，、37、下培养45 d，再分离脾细 胞，进行细胞融合。二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择细胞融合的基本方法是，取适量脾

10、细胞(110日)与骨髓瘤细胞(23XlO)进行混合.在聚 乙二醇(polyethylene glycol， PEG)作用下诱导它们融合，时间控制在2 min以内，然后用培养液 将PEG融合液缓慢稀释。用于细胞融合的骨髓瘤细胞应具备融合率高，自身不分泌抗体，所产 生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。表4-l列举了主要的骨髓瘤细胞系，其 中SP2/0 ，细胞本身不分泌抗体，细胞融合后产生的杂交瘤细胞只分泌均白的、完全来自 脾细胞的抗体分子，它们是目前较为理想可供融合的骨髓瘤细胞，特别是SP2/0细胞系还具有 易培养，融合率高等特点，被国内外多个实验室广泛采用。一般来说，PEG的相对分子

11、质量和浓度越大.其促融率越高。但其和度和对细胞的毒性也 随之增大。目前常用的PEG浓度为40%50 ，相对分子质量以4 000为佳。但相对分子质量 4006 000，浓度在10%-60%范围之间的PEG都能使细胞发生融合。为了提高融合卒，浓度在 PEG 溶液中加入二甲基亚枫(DMS() ，以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但是，PEG和 DMSO都对细胞有毒性，必须严格限制它们和细胞的接触时间.可通过低速离心5 min使细胞接 触更为紧密，然后用新配制的培养液来稀释药物并洗涤细胞。细胞融合后，不但可以产生多种融合细胞，如脾脾、脾-瘤、瘤瘤的融合细胞，而且还有许多未融合的骨髓瘤细胞。这些未融合

12、的细胞比脾-瘤融合的杂交瘤细胞增殖更快，并能将融合细胞淘汰。为此，应将融合后的细胞立即移入选择性培养基中进行培养。常用的选择培养基为 HAT培养基，它是用次黄瞟岭(H)、氨基喋岭(A)和胸腺嘧啶(T)配制的。其中氨基喋岭(A)能阻断DNA合成的主要途径.瘤瘤融合细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾脾融合细胞和瘤细胞在这样的组织培养条件，几天内亦迅速死亡。 由于由于SP2SP20 0等骨髓瘤细胞都是次黄嘌呤鸟瞟岭磷酸核糖转移酶等骨髓瘤细胞都是次黄嘌呤鸟瞟岭磷酸核糖转移酶(HGPRT)(HGPRT)缺乏株，脾细胞内却有这种酶，因此脾缺乏株，脾细胞内却有这种酶，因此脾- -瘤融合的杂交瘤细瘤融合的

13、杂交瘤细 胞胞可利用可利用HGPRTHGPRT，用次黄瞟岭，用次黄瞟岭(H)(H)和胸腺嘧啶和胸腺嘧啶(T)(T)合成合成DNADNA，使杂交瘤细胞，使杂交瘤细胞得以生长。选择得以生长。选择 性培养的常规方法是将融合的细胞悬浮于性培养的常规方法是将融合的细胞悬浮于HATHAT的培养的培养液液( (表表4 - 2)4 - 2)中，加入到含有饲养细胞中，加入到含有饲养细胞 的的9696孔板内孔板内. .根据情况每根据情况每23 d23 d换液一次。换液时吸去换液一次。换液时吸去l/22/3l/22/3培养液，加入等量的新鲜培养液，加入等量的新鲜 培养液。在培养液。在融合后融合后7 d7 d内用内用

14、HATHAT培养液，杀死瘤瘤融合细胞后，第七天至第十四天培养液，杀死瘤瘤融合细胞后，第七天至第十四天改用改用HT HT 培养液，第十四天以后用普通的培养液，第十四天以后用普通的RPMl1640RPMl1640完全培养液完全培养液( (表表4 - 4 - 3)3)，从融合后，从融合后89d89d就可对所就可对所 有克隆生长孔的培养上清进行抗体检测，有克隆生长孔的培养上清进行抗体检测，筛选出产生抗体的阳性克隆。筛选出产生抗体的阳性克隆。由于在最适宜的培养 条件下，大约有105个脾细胞才能形成一个杂交瘤细胞，大量瘤细胞在日AT培养液中相继死 亡，单个或少数的杂交瘤细胞多半不易存活，所以通常要加入饲养

15、细胞才能使其繁殖。常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞等。一般认为饲养细胞能释放某些生长刺激因 子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。小鼠腹腔巨噬细胞还能清除死亡细胞，故应用得 较多。三、筛选阳性克隆与克隆化三、筛选阳性克隆与克隆化因为产生特定抗原的抗体产生细胞只占所有的脾细胞的5左右，所以要进行每孔培养上清的抗体活性的筛选工作，以选择出阳性克隆，然后进行克隆化培养。为了尽快地筛选出阳性克 隆.必须采用微量、快速、特异、敏感、简便并一次能检测大批标本的方法。常用的检测方法有免 疫酶技术、免疫荧光技术和放射免疫技术等。根据筛选抗原的性质和纯度等要求来选用相应的 方法。免疫酶技术

16、因不需进行同位素操作，方法简便，又适于检测大批标本等优点而被广泛采 用。通过引入生物素-亲和素等放大系统可进一步提高灵敏性。一般来说免疫酶技术和放射免 疫技术均适用于可溶性抗原及颗粒性抗原的抗体检测。免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检 测，特别是制备以检测患者活检组织标本为目的抗体时，免疫荧光法则更有意义，在筛选抗体的 同时，还能对所识别的抗原进行定位判定。下面以酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选抗破伤风毒 素抗体为例进行说明(图4 - 3)。筛选出来的阳性克隆中，可能含有不分泌抗体的细胞或有多株分泌抗体的细胞，而且刚融合获得的杂交瘤细胞不稳定，染色体丰易丢 失，因此应尽早进行克隆化。克隆化是

17、指 单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团 的整个培养过程。这种细胞集团每个细 胞的生物学特性和功能完全相同。般 融合后获得的杂交瘤细胞要经过三次左 右的克降化，才能达到100%孔内均为抗 体阳性细胞克隆。常用的克隆化方法有 两种，即有限稀释法和软琼脂法。有限稀 释法是把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96 孔细胞培养板中。使每个孔中在理论上 只含有一个细胞。第一次克隆化时也要 应用日HT 培养液，以后的克隆化可用不含 HT的RPM1l640 培养液。由于单个细胞 难以存活，克隆化时也需加入饲养细胞辅 助其生长。软琼脂法是在培养液中加人左右的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形 成小球样团块，由于培养基是半固体状

18、 态，可用毛细吸管将小球吸出，团块经打碎后，移入96孔板中继续培养。用这种 方法可以吸出大量克隆细胞进行培养，因 初代细胞很不易增殖。所以用软琼脂法进 行克隆化容易成功。四、杂交瘤细胞抗体性状的鉴定四、杂交瘤细胞抗体性状的鉴定对杂交瘤细胞进行染色体分析，不仅可作为鉴定的客观指标，还能帮助了解其分泌抗体 的能力。正常鼠的脾细胞染色体数为40，全部是端着丝粒染色体。小鼠骨髓瘤细胞的染色体 数变异较大， SP2/0细胞为6268，NS-l细胞为5464，大多数为非整倍性，并且有中部着丝 粒染色体和亚中部着丝粒染色体。杂交瘤细胞的染色体在数目 上接近两种亲本细胞染色体 数目的总和，在结构I除多数为端着

19、士生粒染色体外，还应出现少数标志染色体。染色体数目 较多且比较集中的杂交瘤细胞能稳定分泌高效价的抗体，而染色体数目少且较分散的杂交瘤 细胞分泌抗体的能力较低。由于不同类和亚类的免疫球蛋白生物学特性差异较大.诸如补体 活化、免疫调理、ADCC效应等，因此要对制备的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，进行Ig的类 和亚类鉴定，可用羊或兔抗Ig-不同类和亚类的抗体，进行免疫扩散或ELISA法来鉴定。在单克隆抗体鉴定中还必须进行亲和力测定，它可为正确选择不同用途的单克隆抗体提供依据; 另外根据需要不同，还应对单克降抗体的特异性、纯度和识别抗原的相对分子质量等进行测定。五、单克隆抗体的大量制备五、单克隆抗体的大

20、量制备大量制备单克隆抗体的方法主要有两种：一种是体外培养法，可获得10g/mld的抗体，另一种是动物体内诱生法.可获得520 mg/ml的sss抗体。目前多采用后者生产制备单克隆抗体D因 为杂交瘤细胞的两种亲本细胞都来自BALB/c小鼠，所以应选用BALB/c小鼠来制备单克隆抗 体。为了使杂交瘤细胞在腹腔内增殖良好，可于注入细胞的几周前预先将具有刺激性的有机溶 剂降脂烷注入腹腔内.以破坏腹腔内膜，建立杂交瘤细胞易于增殖的环境。动物体内诱生法操作 简便，比较经济，所得单克隆抗体量较多且效价较高，可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已经污 染杂菌的杂交瘤细胞株，缺点是小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，

21、给纯化带来难度。具体 方法是在接种杂交瘤细胞前12周，先给小鼠腹腔注射0.5 ml降脂烷(或用液体石蜡)，然后给 小鼠注射1X106个杂交瘤细胞，待生成腹水后再抽取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。一般在 接种杂交瘤细胞后712 d便能抽取到腹水，抽取几次.即可达10余mL体外培养法多采用 RPMI1640培养液，添加10%20%胎牛或小牛血清 由于培养液中含有血清成分，总蛋白量 可达100 mg/ml以上，给纯化带来困难。加入小牛血清容易发生支原体污染，而且批间质量差 异太大直接影响杂交瘤细胞生长，所以近年来发展了无血清培养法，即利用白蛋白、膜岛素、转铁 蛋白、乙醇胶等混合物代替小牛血清。虽然

22、该法可减少污染又有利于单克隆抗体的纯化，但产量 不高。近来又利用悬浮培养方式代替静止培养法，以增加细胞生长空间，使杂交瘤细胞生长旺 盛.单克隆抗体产量亦得到提高。连续悬浮培养的细胞密度可达2. 0X 107个/ml收集的单克隆 抗体吁达400g/ml左右。如在培养液中加入团体颗粒作为细胞生长的载体，增大单位体积的 表面积，便利杂交瘤细胞生长，细胞密度可达108个/rnl，并能收获更多的单克隆抗体。此方法称 为微载体悬浮培养法.团体颗粒用DEAESephadex A 50等材料制成。六、单克隆抗体的纯化六、单克隆抗体的纯化由于单克隆抗体的Ig的类别和亚类的不间，纯化的方法亦不同，因此在纯化之前必

23、须明确某 Ig的类与亚类。另外根据用途不间也应选择不同的纯化方法，如用于体外诊断试剂，IgG类抗体应 采用沉淀处理结合亲和层析的方法.IgM类抗体应采用沉淀处理结合凝胶过滤的方法。若制备体内诊断试剂或治疗用药则应注意去除内毒素、病毒、核酸等微量的污染物，必须经亲和层析和阴 离子交换层析处理。动物体内诱生法制备的单克隆抗体的具体纯化方法及 般过程如下。1.1.澄清和沉淀处理澄清和沉淀处理由于小鼠腹水中含有红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块及脂质等，应首先用1 000 g离心 5 min，去除沉淀物，再用20000g高速离心30 min，去除残留的小颗粒物质，然后用O. 2m的 微孔滤膜过滤，除掉污染

24、的细菌、支原体和脂质，最后用饱和硫酸铵沉淀抗体，50%饱和硫酸铵能回收90%以上的单克隆抗体。2.2.分离分离根据用途不同可选用不同的方法，主要分离方法有凝胶过滤、阴离子交换层忻、亲和层析等方法。(1)凝胶过滤凝胶过滤用于IgG和IgM类单克隆抗体的分离纯化。常用Scphadex G 200作分离介质，可收集到三个峰最高峰为IgM，另外两个峰为IgG，抗体凶收率达50.%80% ，能去除污染的微量杂蛋白.抗体纯度可达95% 以上。(2)阴离子交换层析用于IgG类单克隆抗体的分离纯化。在条件下,IgG1和IgG2能结合在DEAE填料 上，其中IgG2a可在较低离子强度条件下洗脱下来，其纯度很高，

25、lgG2b、IgG，在低离子强度下易发 生沉淀，可增加离子强度以提高产量，但其纯度相对较低。在条件下.把杂交瘤细胞培养的 上清液加到琼脂糖柱上时，所有的抗体都能结合到柱上，而55%的杂蛋白可被洗脱掉，再用不同离 子强度的洗脱剂洗下。在最适离子强度及pH条件下，以离子交换层析分离单克隆抗体可以提高 纯度25 100倍。高容量、高流速、化学稳定的新型离子交换剂适宜单克隆抗体的大规模纯化。(3)亲和层析多用蛋白A亲和层析，适用于IgG类单克隆抗体的纯化。IgG与蛋白A的结合与pH有密切 关系，鼠源性单克隆抗体在时，lgG2b、IgG3，几乎全部结合于蛋白A柱上，lgG1稍差，用缓冲液可洗脱下IgG2

26、b，pH 4. 0缓冲液可洗脱下 IgG2a，缓冲液可洗脱下 IgG2a，pH 6.0 可洗脱下 IgG1用蛋白A亲和层析收获的抗体纯度很高，但也有极微量的杂蛋白。第三节第三节 墓因工程抗体及其制备墓因工程抗体及其制备Ig分子是由二硫键连接起来约4条(两对)多肽链构成的(图4 - 4)，长的一才称为重链(heavy chain， II链)，有450 570个氨基酸残基，短的一对称为轻链，约有214个氨基酸残基。Ig分子氨基端L链的1/2与H链的1/4区段的氨基酸组成及排列顺序多 变，称为可变区(varible region， V区)。羟基端L链的1 /2与H链的3/4，氨基酸的组成和排列比较恒

27、定，称为恒定区(constant region. C区)在V区中，某些特定位置的氨基酸残基显示更 大的变异性，构建了抗体分子和抗原分子发生特异性结合的关键部位，将其称为互补决定区(complementary determining region，CDR)。而C区则决定了Ig分子的异种抗原性。如将鼠源 性单克隆抗体的C区用人的Ig分子的C区置换，则对人的免疫原性消失。如果保留鼠源性单 克隆抗体的CDR区的结构，抗体活性就能不消失，CDR 区以外的其他部分存在与否都不影响其 抗体活性。基因工程抗体领域的研究重点之就是降低鼠源性单克隆抗体分子的免疫原性，所 以在基因工程抗体的研究中，先后研制出多种人

28、源化的单克隆抗体，如人鼠嵌合抗体、改形抗 体等。另外.Ig分子是由若干折叠成球形结构组成的一种立体构形，每一个球形结构是肽链的一个亚单位；约由110个氨基酸组成，共有一定的生理功能，故称为功能区。L链有Vl和Cl两 个功能区，H链有Vh和CHI、CH2、CH3等4个功能区，Vl和VH的CDR区共同构成4个抗原结合部位。而且，Ig分子的多肽链是由多基因决定的(图4 - 5)，例如型L链是由三个基因编码 的，v基因编码起始部95个（195)氨基酸，j(连接)基因编码13个(96108)氨基酸.C基因编 码105个(l09214)氨基酸。H链是由4个基因，即VH，DH(多样性)、JH和CH基因编码的

29、。 因为特异性结合抗原的功能是抗体分子诸多功能中最主要的功能，如果只克隆出V区基因，并 使其表达，则编码的抗体分f的相对分子质量会很小，就叫研制出小分子的基因工程抗体。研制 基因工程抗体的另一个目的，就是降低抗体的相对分子质量，以增加组织的透过性。因此，在短 短的几年中，先后研制出多种类型的小分子基因工程抗体(如单链抗体、单域抗体等)。一、人鼠嵌合抗体一、人鼠嵌合抗体由于抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的可变区(V)，同种性免疫原性决定下抗体分子的稳定区(c)，如果在基因水平上把鼠源性单克隆抗体的重链（H）和轻链(L)可变区分离出 来，分别与人Ig的重链和轻链的稳定区(C)基因连接成人鼠嵌合

30、体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的人鼠嵌合抗体。其制备方法是:提取杂交瘤细胞系的mRNA，经过反转录成cDNA，并以其为模板，采用特 异性引|物，用多聚酶链反应(PCR)方法分别扩增VL和VH基肉，再分别连接真核表达所帘的上游启动子、前导链序列和下游剪切供体信号、增强子真核调控序列后，将Vl基因克隆到人IgC， 基因表达载体上，将VH基因克隆到人Ig的C基因其核表达载体上，再将人-鼠嵌合的V-C 区基因质粒DNA等量混合，在脂质体介导下共转染骨髓瘤细胞SP20，转染后用霉酚酸进行筛 选，形成集落的细胞即为共转染细胞.所分泌的抗体为嵌合抗体。它保持鼠源性单克隆抗体的抗 原结合

31、的特异性，但对人的免疫原性大幅度下降了。如若用人IgG1或IgG3的C基因替换鼠 IgG1，或IgG2b，则可有效地加强多肤的ADCC效应与免疫调理作用。二、改形抗体二、改形抗体Ig分子中参与构成抗原综合部位的区域是H和L链V区中的互补性决定区(CDR区)，而不是整个可变区。H和L链各有三个CDR，其他部分称为框架区。如果用鼠源性单克隆抗体的CDR 序列替换人的Ig分子中的CDR序列，则可使人的Ig分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合的特异性。抗体分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。这种改形抗体又称CDR移植抗体。目前已报道了近70种针对不同抗原的鼠源性单克隆抗体的改形抗体，如表4-

32、5所示。在构建议形抗体时，遇到的最大问题是抗体亲和力下降，甚至丧失活性。其原因是人Ig分 子的框架区中的一些氨基酸与鼠Ig的CDR区不协调。Jones 等学者将鼠和人的Ig的V区序列 与其所属家族的保守序列进行比较分析后发现，如将鼠的可能发生突变的残基，与亲和性有关残 基引人人Ig的恒架区巾，叮显著提高抗体的亲相力，成功构建出CDw52(CAMPATH-I-H)等多 种改形抗体。选择KJ鼠源性单克隆抗体同源性最大的人Ig分子为框架区序列，将人Ig中较为独特的残基替换成鼠的CDR区附近的框架氏的残基，抗体亲和力比原来鼠源性抗体提高30%， 利用本方法成功地构建出IL-2受体的政形抗体等.上述使用

33、的与鼠对应部分有较大同源性的人框架区替换鼠框架区的方法称模板替换。对鼠CDR及框架区表面残基进行镶饰或重塑使其 类似于人抗体CDR轮廓戎人框架区的方法称表面意塑。在人的框架区选择与CDR有相互作 用，与抗体的亲和力街密切关系或对框架区空间结构折叠起关键作用的残基进行改变，以补偿完 全的CDR移植的方法称为补偿变换。在人源化的政形抗体中保留r鼠源性抗体可变区中参与 抗原结合的氨基酸残基包括CDR和框架区中的一些关键残基的方法称为定位保留。三、三、FABFAB与与FVFV抗体抗体用胃蛋白酶可将IgG的重链在饺链区的C端处裂解，获得两个完全相同的抗原结合片段 (fragment of antigen

34、 binding，Fab)，在Fab片段之间仍保留有饺链区与二硫键，为Fab双体，具有完整的双价抗体活性，但相对分子质量减少了1/3，为10 000，在人体内产生的抗鼠蛋白的排斥反应也相应的降低至30%，由于仍保持抗体分子的立体构型，因此在人体仍然很稳定，成为小分子抗体的雏形，称Fab抗体。Givol等用回蛋白酶水解抗DNP(二硝基苯盼)单克隆抗体产生 Fab片段后，过Sephadcx G-75柱时，显示出两个峰，第一个峰为Fab主峰a收集第三个峰提取物进一步研究发现，这个较小的抗体结合片段的分手大小约为Fab的一半，从相对分子质量、N端序列、结合作用和亲和力等参数分析，这个片段含有L链和Fd

35、链一半的N端可变区，具有与完整抗体相似的结合能力，因此命名为抗体口可变区片段，称Fv抗体。Hochman等发现8 mol/L尿素可使Fv分离为VH和VL，并且分离的VH和VL又可快速重新结合成高亲和力的FVL说明Ig分子结构中的可变区是作为完整区域存在的，不依赖抗体的 其他肽段能正确折叠.这个结论对于制备Fv抗体是非常重要的。根据Fv片段三维空间纺构的 X射线晶体结构分析，发现Fv的VH和的C端位于分子表面并远离抗原结合位点，而其K 端掩蔽在分子内部并靠近抗原结合位点，VH和VL的CDR区共同构成了抗原结合位点.决定了抗体的特异性。各种单价的Ig片段如图（4-6）所示，其中靶抗原结合区(target binding region， TBR)只有一个，故为单价分子。Fv是由VH和VL组成的具有完整抗原结合位点的最小抗体片段，表现出与完整抗体相似的结合活性，它的发现推动了抗体的体外重组技术的发展。体外表达的高产量、天然活性的Fv为蛋白均一的小分子，重组技术制备的Fv抗体又推动了对对抗体结构和功能的分析及抗体的改建，为Fv抗体的临床应用奠定了基础。四、单链抗体四、单链抗体单链抗体(single chain FVLscFv)是由一段弹性连接肽（linker)把抗体可变区重链(VH)与轻链(VL)相连而成，是