第五章氨基酸、蛋白质提取工艺特性

1、第五章氨基酸、蛋白质提取工艺特性l因氨基酸分子较小，且有羧基、氨基，同时具有碱因氨基酸分子较小，且有羧基、氨基，同时具有碱性和酸性极性基团较多，所以它的极性较大，能溶性和酸性极性基团较多，所以它的极性较大，能溶于水，不溶于有机溶剂。因同时具有羧基和氨基，于水，不溶于有机溶剂。因同时具有羧基和氨基，有酸碱两性的性质，能与酸和碱形成不同的盐。当有酸碱两性的性质，能与酸和碱形成不同的盐。当溶液的溶液的pH发生变化时，溶液中的离子状态也发生了发生变化时，溶液中的离子状态也发生了变化。在电场中酸性溶液的氨基酸则向阴极电泳，变化。在电场中酸性溶液的氨基酸则向阴极电泳，而在碱性溶液中则向阳极电泳，当溶液的而

2、在碱性溶液中则向阳极电泳，当溶液的pH值达一值达一定时，氨基酸不向任何电极移动，此时溶液的定时，氨基酸不向任何电极移动，此时溶液的pH值值就是该氨基酸的等电点。不同的氨基酸有不同的等就是该氨基酸的等电点。不同的氨基酸有不同的等电点，在等电点时氨基酸的溶解度最低，根据这种电点，在等电点时氨基酸的溶解度最低，根据这种性质可以用电泳法分离氨基酸。性质可以用电泳法分离氨基酸。l氨基酸在适当的条件下，能进行有机胺或有机酸的氨基酸在适当的条件下，能进行有机胺或有机酸的几乎全部反应。与一般的酸和碱可生成稳定的盐，几乎全部反应。与一般的酸和碱可生成稳定的盐，大部分均能溶于水，但与重金属如铜、银、汞等制大部分均

3、能溶于水，但与重金属如铜、银、汞等制成的络合物不溶于水，也可利用这种性质来分离氨成的络合物不溶于水，也可利用这种性质来分离氨基酸。基酸。l水浸出法：将中草药以粉碎机粉碎，装入水浸出法：将中草药以粉碎机粉碎，装入逆流浸出罐组的每一个浸出罐中。用水做浸逆流浸出罐组的每一个浸出罐中。用水做浸出溶剂，最好在有搅拌的条件下，加热进行出溶剂，最好在有搅拌的条件下，加热进行逆流浸出。逆流浸出。l稀乙醇浸出法：将生药粉末装入逆流渗滤稀乙醇浸出法：将生药粉末装入逆流渗滤浸出罐组的每一个浸出罐中。以浸出罐组的每一个浸出罐中。以70%乙醇进乙醇进行渗滤浸出，先浸出的溶液浓度较大，后浸行渗滤浸出，先浸出的溶液浓度较大

4、，后浸出的溶液浓度较低。最好采用逆流渗漉浸出出的溶液浓度较低。最好采用逆流渗漉浸出法，把出液系数控制在法，把出液系数控制在5，可以得到较好的浸，可以得到较好的浸出效果。出效果。 l水浸出液或稀乙醇减压浓缩后的水溶液往往含水浸出液或稀乙醇减压浓缩后的水溶液往往含有几种或十几种氨基酸，因此所得的是总氨基有几种或十几种氨基酸，因此所得的是总氨基酸，必须进行分离纯化。一般采用以下的纯化酸，必须进行分离纯化。一般采用以下的纯化方法：方法：l离子交换法离子交换法:这是分离氨基酸的常用方法。可这是分离氨基酸的常用方法。可直接将水或稀乙醇提取物通过装有离子交换树直接将水或稀乙醇提取物通过装有离子交换树脂的交换

5、柱，带正荷的氨基酸与树脂上的脂的交换柱，带正荷的氨基酸与树脂上的- -SO基吸附。由于氨基酸带的正电荷随溶液基吸附。由于氨基酸带的正电荷随溶液pH发生发生变化，同一氨基酸在不同变化，同一氨基酸在不同pH的缓冲溶液中，以的缓冲溶液中，以及不同氨基酸在同一及不同氨基酸在同一pH的环境中，所带的正电的环境中，所带的正电荷各不相同，与磺酸基吸附的强弱也相应不同。荷各不相同，与磺酸基吸附的强弱也相应不同。可以借助这种差别，使氨基酸互相分离。可以借助这种差别，使氨基酸互相分离。l成盐分离法成盐分离法:利用某些酸性氨基酸与某些金属利用某些酸性氨基酸与某些金属化合物，如氢氧化钡、氢氧化钙生成难溶性盐，化合物，

6、如氢氧化钡、氢氧化钙生成难溶性盐，或某碱性氨基酸与一般酸生或某碱性氨基酸与一般酸生 成盐，从而与其他成盐，从而与其他未成盐的氨基酸分离。如南瓜子中的南瓜子氨基未成盐的氨基酸分离。如南瓜子中的南瓜子氨基酸是通过与过氯酸生成结晶性盐而分出的。酸是通过与过氯酸生成结晶性盐而分出的。l晶析法晶析法:利用不同氨基酸等电点不同，进行晶利用不同氨基酸等电点不同，进行晶析结晶分离。例如在含有亮氨酸、异亮氨酸和缬析结晶分离。例如在含有亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的溶液，其氨酸的溶液，其pH值为值为1.52.0时，浓缩先晶析时，浓缩先晶析出亮氨酸，它的母液加盐酸后再浓缩晶析出异亮出亮氨酸，它的母液加盐酸后再浓缩晶析出

7、异亮氨酸，最后母液中回收缬氨酸。氨酸，最后母液中回收缬氨酸。 l四、氨基酸、肽的鉴别反应四、氨基酸、肽的鉴别反应l茚三酮茚三酮(Ninhydrin)反应：所有的反应：所有的a-氨基酸及含氨基酸及含有有a-氨基酸的肽类和蛋白质都能和该试剂反应呈氨基酸的肽类和蛋白质都能和该试剂反应呈现兰色或兰紫色。必要时加热，反应可在滤纸上现兰色或兰紫色。必要时加热，反应可在滤纸上进行。进行。l(2)吲哚醌吲哚醌(Isatin）试剂反应：不同的氨基酸与吲）试剂反应：不同的氨基酸与吲哚醌试剂反应，能显示不同的颜色。由于试剂的哚醌试剂反应，能显示不同的颜色。由于试剂的配制方法不同，对同一种氨基酸所显示的颜色也配制方法

8、不同，对同一种氨基酸所显示的颜色也往往有差异。吲哚醌不仅可用于氨基酸的显色，往往有差异。吲哚醌不仅可用于氨基酸的显色，而且从其颜色的区别，可以帮助辨认氨基酸。显而且从其颜色的区别，可以帮助辨认氨基酸。显色不稳是其特点，氨对显色无干扰。色不稳是其特点，氨对显色无干扰。 l一、不同结构的蛋白质及其溶解性质一、不同结构的蛋白质及其溶解性质l蛋白质按其功能可分为活性蛋白和非活性蛋白蛋白质按其功能可分为活性蛋白和非活性蛋白二类；二类；l按结构又可分为简单蛋白和结合蛋白二类：按结构又可分为简单蛋白和结合蛋白二类：l再一种分类是根据蛋白质的溶解度差别而分为再一种分类是根据蛋白质的溶解度差别而分为水溶性蛋白、

9、醇溶性蛋白等，还有一类硬蛋白，水溶性蛋白、醇溶性蛋白等，还有一类硬蛋白，不溶于水、稀酸、稀碱和有机溶剂，遇强酸、不溶于水、稀酸、稀碱和有机溶剂，遇强酸、强碱水解。强碱水解。 蛋蛋 白白 质质 类类 别别溶溶 解解 性性 质质简单蛋白质简单蛋白质1.白蛋白白蛋白2.球蛋白球蛋白 a.真球蛋白真球蛋白 b.拟球蛋白拟球蛋白3.醇溶蛋白醇溶蛋白4.谷蛋白谷蛋白5.精蛋白精蛋白6.组蛋白组蛋白1、溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被、溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和饱和度硫酸铵析出。度硫酸铵析出。2、a.一般在等电点不溶于水，但加一般在等电点不溶于水，但加入少量的盐、碱则可溶解。入少量的盐、

10、碱则可溶解。 b.溶于水，可为溶于水，可为50%的饱和度硫酸铵析出。的饱和度硫酸铵析出。3、溶于、溶于7080%乙醇中，但不溶于水及无水乙醇。乙醇中，但不溶于水及无水乙醇。4、在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀、在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸，稀酸，稀 碱溶液。碱溶液。5、溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀。、溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀。6、溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀。、溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀。硬蛋白质硬蛋白质不溶于水、盐、稀酸、稀碱不溶于水、盐、稀酸、稀碱结合蛋白质结合蛋白质(包括磷蛋白、粘包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂

11、蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白等等)此类蛋白质溶解度性质随蛋白质与非蛋白结合部分此类蛋白质溶解度性质随蛋白质与非蛋白结合部分的不同而异，的不同而异， 除脂蛋白外，一般可溶于稀酸，稀碱除脂蛋白外，一般可溶于稀酸，稀碱及盐溶液中，脂蛋白如脂质部分露于外，则脂溶性及盐溶液中，脂蛋白如脂质部分露于外，则脂溶性占优势，如脂质部分被包围于分子之中，则水溶性占优势，如脂质部分被包围于分子之中，则水溶性占优势。占优势。l1.水溶液提取水溶液提取 凡能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱的凡能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱的蛋白质或酶，一般都可用稀盐溶液或缓冲溶液进蛋白质或酶，一般都可用稀盐溶液或

12、缓冲溶液进行提取。稀盐溶液有利于稳定蛋白质结构和增加行提取。稀盐溶液有利于稳定蛋白质结构和增加蛋白质溶解度。加入的提取液的量要适当，加入蛋白质溶解度。加入的提取液的量要适当，加入量太少提取不完全，加的量太多，则不利于浓缩，量太少提取不完全，加的量太多，则不利于浓缩，一般用量为原材料一般用量为原材料36倍体积左右，可一次提取倍体积左右，可一次提取或分次提取。提取时常缓慢搅拌，以提高提取效或分次提取。提取时常缓慢搅拌，以提高提取效率。以盐溶液或缓冲液提取蛋白质和酶时，常综率。以盐溶液或缓冲液提取蛋白质和酶时，常综合考虑下列因素：合考虑下列因素： l(1)盐浓度：提取蛋白质的盐的浓度，一般盐浓度：提

13、取蛋白质的盐的浓度，一般在在0.020.2M的范围内。常用稀溶液和缓的范围内。常用稀溶液和缓冲液有冲液有0.020.05M磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，0.090.15M氯化钠溶液。氯化钠溶液。 l(2)pH值：蛋白质和酶所用的提取液值：蛋白质和酶所用的提取液pH值值一般选择在被提取的蛋白质等电点两侧的一般选择在被提取的蛋白质等电点两侧的稳定区内。稳定区内。l (3)温度：蛋白质和酶一般都不耐热，所以温度：蛋白质和酶一般都不耐热，所以提取时通常要求低温操作。提取时通常要求低温操作。l一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，的蛋白质和酶，难

14、溶于水、稀盐、稀酸和稀碱，常难溶于水、稀盐、稀酸和稀碱，常用有机溶剂提取。如丙酮、异丙醇、乙醇、正丁醇用有机溶剂提取。如丙酮、异丙醇、乙醇、正丁醇等，均可溶于水或部分溶于水，这些溶剂都同时有等，均可溶于水或部分溶于水，这些溶剂都同时有亲脂性和亲水性。其中正丁醇有较强的亲脂性，也亲脂性和亲水性。其中正丁醇有较强的亲脂性，也有一定亲水性，在有一定亲水性，在0时于水中有时于水中有10.5的溶解度。的溶解度。它在水和脂分子间起着类似去污剂的作用，取代蛋它在水和脂分子间起着类似去污剂的作用，取代蛋白质与脂质重新与蛋白质结合，使原来蛋白质在水白质与脂质重新与蛋白质结合，使原来蛋白质在水中溶解度大大增加。丁

15、醇在水溶液及各种生物材料中溶解度大大增加。丁醇在水溶液及各种生物材料中解离脂蛋白的能力极强，是其他有机溶剂所不及中解离脂蛋白的能力极强，是其他有机溶剂所不及的。我国生化工作者曾用此法成功地提取了琉拍酸的。我国生化工作者曾用此法成功地提取了琉拍酸脱氢酶，对于碱性磷酸醋酶的提取效果也十分显著。脱氢酶，对于碱性磷酸醋酶的提取效果也十分显著。l有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于一定比例的有机溶剂。在这样的能溶于一定比例的有机溶剂。在这样的情况下，采用稀的有机溶剂提取常常是情况下，采用稀的有机溶剂提取常常是为防止水解酶的破坏，并兼有除杂和提为防止水解酶的破坏，并兼

16、有除杂和提高纯化效果的作用。高纯化效果的作用。3 3、从细胞膜上提取水溶性蛋白质的方法、从细胞膜上提取水溶性蛋白质的方法l膜上的蛋白质或酶一般有两种存在状态，一是在膜上的蛋白质或酶一般有两种存在状态，一是在膜表面上，与膜成分联系比较松；第二是膜的内膜表面上，与膜成分联系比较松；第二是膜的内在成分之一，或与膜成分结合较紧。蛋白质与膜在成分之一，或与膜成分结合较紧。蛋白质与膜成分的结合可通过脂质形成复合物，也可以通过成分的结合可通过脂质形成复合物，也可以通过金属离子与膜成分结合，或与膜其他蛋白质形成金属离子与膜成分结合，或与膜其他蛋白质形成复合物。与膜成分结合较松的蛋白质或酶，经过复合物。与膜成分

17、结合较松的蛋白质或酶，经过充分破碎细胞，在一定充分破碎细胞，在一定pHpH范围用稀盐溶液即可提范围用稀盐溶液即可提取分离。但一些与膜成分结合较牢或属于膜组成取分离。但一些与膜成分结合较牢或属于膜组成的蛋白质，提取则比较困难，须用超声波、去污的蛋白质，提取则比较困难，须用超声波、去污剂或其他比较强烈的化学处理，才能从膜上分离剂或其他比较强烈的化学处理，才能从膜上分离出来。主要方法有：出来。主要方法有：l(1)(1)浓盐或尿素等溶液提取浓盐或尿素等溶液提取 如如NaClONaClO4 4、尿素、肌、尿素、肌盐酸等溶液均有人应用于提取膜蛋白，当以上溶盐酸等溶液均有人应用于提取膜蛋白，当以上溶液浓度达

18、到液浓度达到2mol/L2mol/L时，可提取时，可提取2727以上的膜蛋白，以上的膜蛋白，但使用这样条件易引起蛋白质和酶的变性。但使用这样条件易引起蛋白质和酶的变性。l(2)(2)碱溶液提取碱溶液提取 碱性条件也可以解离与膜上成碱性条件也可以解离与膜上成分结合的蛋白质。在分结合的蛋白质。在pH8-10pH8-10范围内，某些膜蛋白范围内，某些膜蛋白随着随着pHpH的提高而溶解度大大增加，至的提高而溶解度大大增加，至pHllpHll时，有时，有40%-5040%-50的膜蛋白被抽出，但碱提取法也容易引的膜蛋白被抽出，但碱提取法也容易引起蛋白质和酶的失活，应用上不广。起蛋白质和酶的失活，应用上不

19、广。l(3)(3)加人金属鳌合剂加人金属鳌合剂 蛋白质通过金属离子与膜蛋白质通过金属离子与膜成分结合时，加人金属鳌合剂如成分结合时，加人金属鳌合剂如EDTAEDTA可使蛋白质可使蛋白质释放出来。用此法曾成功地提取了膜上释放出来。用此法曾成功地提取了膜上ATPATP酶的偶酶的偶联因子联因子I I 。EDTAEDTA与超声波联合处理抽提膜上的磷与超声波联合处理抽提膜上的磷酰转移酶效果更好。酰转移酶效果更好。l(4）有机溶剂抽提）有机溶剂抽提 使用乙醇、吡啶、叔戊醇、正使用乙醇、吡啶、叔戊醇、正丁醇等溶剂抽提及用冷丙酮做成丙酮粉，是提取丁醇等溶剂抽提及用冷丙酮做成丙酮粉，是提取膜上与脂质结合的脂蛋白

20、或膜内脂蛋白组分最常膜上与脂质结合的脂蛋白或膜内脂蛋白组分最常用也较有效的方法，其中叔戊醇及正丁醇用于膜用也较有效的方法，其中叔戊醇及正丁醇用于膜内脂蛋白效果尤佳。前已提到正丁醇可在广泛的内脂蛋白效果尤佳。前已提到正丁醇可在广泛的pH (pH3-10)和温度范围（和温度范围（-240）内使用。用）内使用。用有机溶剂结合其他方法已成功地提取了多种膜上有机溶剂结合其他方法已成功地提取了多种膜上蛋白质和酶，如蛋白质和酶，如NPDH脱氢酶、唬珀酸脱氢酶、脱氢酶、唬珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、碱性磷酸酯酶、胆碱酯酶等。细胞色素氧化酶、碱性磷酸酯酶、胆碱酯酶等。l(5)(5)去垢剂处理去垢剂处理 去垢剂处

21、理是目前广泛应去垢剂处理是目前广泛应用于提取膜上水溶性蛋白和脂蛋白的方法，常用于提取膜上水溶性蛋白和脂蛋白的方法，常用的去垢剂有弱离子去垢剂脱氧胆酸盐、胆酸用的去垢剂有弱离子去垢剂脱氧胆酸盐、胆酸盐，强离子型去垢剂十二烷基磺酸钠盐，强离子型去垢剂十二烷基磺酸钠(SDS(SDS）和）和非离子型去垢剂非离子型去垢剂Triton X-100Triton X-100和和Tween, LubrolTween, Lubrol和和BrijBrij等。等。l去垢剂处理膜蛋白时的浓度通常为去垢剂处理膜蛋白时的浓度通常为1 1左右，用左右，用此法提取的膜蛋白和酶有细胞色素此法提取的膜蛋白和酶有细胞色素BSBS、胆

22、碱醋、胆碱醋酶、细胞色素氧化酶、酶、细胞色素氧化酶、DPNHDPNH氧化酶、氧化酶、ADP/ATPADP/ATP载载体蛋白等。体蛋白等。l用去垢剂分离膜蛋白时，选择去垢剂首先考虑：用去垢剂分离膜蛋白时，选择去垢剂首先考虑：去垢剂的溶解能力；去垢剂的温和性。强离去垢剂的溶解能力；去垢剂的温和性。强离子型去垢剂（如子型去垢剂（如SDS)一般具有很好的溶解能力，一般具有很好的溶解能力，但温和情况不理想，容易引起蛋白质变性。弱离但温和情况不理想，容易引起蛋白质变性。弱离子型或非离子型去垢剂对蛋白质变性影响较小，子型或非离子型去垢剂对蛋白质变性影响较小，而溶解能力差。去垢剂的溶解能力与溶液的离子而溶解能

23、力差。去垢剂的溶解能力与溶液的离子强度大小有关。一般来说，离子强度增加，去垢强度大小有关。一般来说，离子强度增加，去垢剂的溶解能力也随之增大。所以使用去垢剂溶解剂的溶解能力也随之增大。所以使用去垢剂溶解膜蛋白时，须考虑各种条件。根据膜蛋白时，须考虑各种条件。根据Klingenberg等等的经验，分离线粒体膜的经验，分离线粒体膜DP/ATP载体蛋白，选用载体蛋白，选用Triton X100比用比用Lubrol, Brij和和Aminoxide等去垢等去垢剂效果更好，所得剂效果更好，所得ADP/ATP载体蛋白具有较高的载体蛋白具有较高的天然活性。但主要缺点是天然活性。但主要缺点是riton X10

24、0在在280nm处有处有强的紫外吸收，干扰用紫外法测定蛋白质的含量。强的紫外吸收，干扰用紫外法测定蛋白质的含量。l(6)(6)加人脂酶或磷酸酯酶水解蛋白质一脂加人脂酶或磷酸酯酶水解蛋白质一脂质复合物质复合物 从蛇毒中提取的磷酸醋酶从蛇毒中提取的磷酸醋酶A A主要作用于磷脂，最适主要作用于磷脂，最适pHpH为为6-86-8。从胰脏。从胰脏中提取的醋酶作用于单、二、三甘油醋，中提取的醋酶作用于单、二、三甘油醋，酶作用最适酶作用最适pHpH为为7-8o7-8o醋酶和磷酸醋酶均需醋酶和磷酸醋酶均需要要Ca Ca 2 2激活。用酶法处理提取的膜蛋白激活。用酶法处理提取的膜蛋白及酶有细胞色素及酶有细胞色素

25、C C、 a- a-磷酸甘油脱氢酶、磷酸甘油脱氢酶、TPNH-TPNH-细胞色素细胞色素C C还原酶等。还原酶等。 蛋白质、多肽及氨基酸都是两性电解质，在一蛋白质、多肽及氨基酸都是两性电解质，在一定定pHpH环境中，某一种蛋白质解离成正、负离子的趋环境中，某一种蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，或解离成两性离子，其净电荷为零，此时势相等，或解离成两性离子，其净电荷为零，此时环境的环境的pHpH值即为该蛋白质的等电点。在等电点时蛋值即为该蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质性质比较稳定，其物理性质如导电性、溶解度、白质性质比较稳定，其物理性质如导电性、溶解度、粘度、渗透压等皆最小，因此可以利用蛋白质

26、等电粘度、渗透压等皆最小，因此可以利用蛋白质等电点时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质。点时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质。 等电点沉淀等电点沉淀 等电点除杂等电点除杂 蛋白质的一个主要特点是：分子大，蛋白质的一个主要特点是：分子大，而且不同种类的蛋白质分子大小也不相等。而且不同种类的蛋白质分子大小也不相等。由此可以用凝胶过滤法、超滤法、离心法由此可以用凝胶过滤法、超滤法、离心法及透析法等将蛋白质与其它小分子物质分及透析法等将蛋白质与其它小分子物质分离，也可将大小不同的蛋白质分离。离，也可将大小不同的蛋白质分离。 凝胶过滤层析凝胶过滤层析 蛋白质的溶解度受溶液的蛋白质的溶解度受溶液的pHp

27、H、离子强度、溶剂、离子强度、溶剂的电解质性质及温度等多种因素的影响。在同一特的电解质性质及温度等多种因素的影响。在同一特定条件下，不同的蛋白质有不同的溶解度，达到分定条件下，不同的蛋白质有不同的溶解度，达到分离的目的。盐溶与盐析，结晶，低温有机溶剂沉淀离的目的。盐溶与盐析，结晶，低温有机溶剂沉淀法。如法。如: :盐析和有机溶剂分级分离法。盐析和有机溶剂分级分离法。 离子交换剂作为一种固定相，本身具有正离子离子交换剂作为一种固定相，本身具有正离子或负离子基团，它对溶液中不同的带电物质呈现不或负离子基团，它对溶液中不同的带电物质呈现不同的亲和力，从而使这些物质分离提纯。同的亲和力，从而使这些物质

28、分离提纯。 蛋白质、蛋白质、多肽或氨基酸具有能够离子化的基团。多肽或氨基酸具有能够离子化的基团。 对蛋白质的离子交换层析，一般多用离子交换对蛋白质的离子交换层析，一般多用离子交换纤维和以葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝纤维和以葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶为骨架的离子交换剂。主要是取得其有较大的蛋胶为骨架的离子交换剂。主要是取得其有较大的蛋白质吸附容量、较高的流速和分辨力。白质吸附容量、较高的流速和分辨力。5.5.根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质。根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质。 主要手段是亲和层析法，即利用蛋白质分子能与主要手段是亲和层析法，即利用蛋白质分子能与其相

29、应的配体进行特异性的、非共价键的可逆性结合其相应的配体进行特异性的、非共价键的可逆性结合而达到纯化的目的。而达到纯化的目的。 固相化金属亲和层析固相化金属亲和层析IMACIMAC是新发展的一种亲和层是新发展的一种亲和层析技术。蛋白质分子中的咪唑基和巯基可与一些金属析技术。蛋白质分子中的咪唑基和巯基可与一些金属元素（如元素（如CuCu2+2+,Zn,Zn2+2+) )形成配位结合，使蛋白质得到分形成配位结合，使蛋白质得到分离纯化。离纯化。 蛋白质上有疏水区，它们主要由酪氨酸、蛋白质上有疏水区，它们主要由酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等非极亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等非极性的侧

30、链密集在一起，并暴露于分子表面。这性的侧链密集在一起，并暴露于分子表面。这些疏水区能够与吸附剂上的疏水性基团结合，些疏水区能够与吸附剂上的疏水性基团结合，在通过降低介质的离子强度和极性等方法将蛋在通过降低介质的离子强度和极性等方法将蛋白质洗脱下来。如疏水相互作用层析白质洗脱下来。如疏水相互作用层析 逆流分配色谱逆流分配色谱8.根据蛋白质受物理、化学等作用因素的根据蛋白质受物理、化学等作用因素的影响来纯化蛋白质。影响来纯化蛋白质。 蛋白质易受蛋白质易受pH、温度、酸碱、金属、温度、酸碱、金属离子、蛋白质沉淀剂，络合剂等的影响，离子、蛋白质沉淀剂，络合剂等的影响，用于各种蛋白质都存在差异，可利用这

31、用于各种蛋白质都存在差异，可利用这种差异来分离纯化蛋白质。种差异来分离纯化蛋白质。 如：电泳法、结晶纯化如：电泳法、结晶纯化 在蛋白质分离中，最广泛使用的吸附在蛋白质分离中，最广泛使用的吸附剂有结晶磷酸钙，磷酸钙凝胶，硅胶，皂剂有结晶磷酸钙，磷酸钙凝胶，硅胶，皂土、沸石、硅藻土、活性白土、氧化铝以土、沸石、硅藻土、活性白土、氧化铝以及活性炭等。如：吸附层析及活性炭等。如：吸附层析 SOD SOD酶抗蛋白水解酶。酶抗蛋白水解酶。 亲和层析亲和层析l总之，蛋白质和酶从细胞内提取出来后，总之，蛋白质和酶从细胞内提取出来后，仍处于十分混杂的体系中，必须进一步纯仍处于十分混杂的体系中，必须进一步纯化。但

32、经过提取除去了大量与制备性质差化。但经过提取除去了大量与制备性质差别较大的杂质，只剩余与制备物理性质大别较大的杂质，只剩余与制备物理性质大致相近或类似的物质。因此，经过有选择致相近或类似的物质。因此，经过有选择性的提取这一步骤，对以后纯化工作创造性的提取这一步骤，对以后纯化工作创造十分有利条件。蛋白质和酶溶剂提取后进十分有利条件。蛋白质和酶溶剂提取后进一步分离纯化常用方法有如下几种：一步分离纯化常用方法有如下几种： l(1)盐析法；盐析法；l(2)等电点沉淀法；等电点沉淀法；l(3)有机溶剂分级分离法；有机溶剂分级分离法；l(4)层析法（凝胶过滤层析、离子交换层析、层析法（凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析）；吸附层析、亲和层析）；l(5)电泳法（等电聚焦电泳、双向凝胶电泳）电泳法（等电聚焦电泳、双向凝胶电泳）l(6)结晶纯化等。结晶纯化等。l四、蛋白质的鉴别方法四、蛋白质的鉴别方法l双缩脲双缩脲(Biuret）反应：本试剂为）反应：本试剂为1 CuS04和和40%NaOH溶液等量混合。主要是溶液等量混合。主要是Cu +2与蛋白与蛋白质或肽分子中肽键质或肽分子中肽键-CO-NH-络合呈