乳兔雪旺细胞对成兔视神经挫伤修复的作用

1、乳兔雪旺细胞对成兔视神经挫伤修复的作用【摘要】目的研究乳兔雪旺细胞(Schwann cell,SC)对成兔视神经挫伤修复的作用。方法建立成兔视神经挫伤模型，伤后24 h分别向伤眼玻璃体腔内注入SC悬液(A组)、生理盐水(B组)各01 ml。伤后不同时间点进行视网膜节细胞(retinal ganglion cell,RGC)、轴突染色记数及闪光视觉诱发电位(flash visual evoked potentials,FVEP)检测。结果伤后4周A、B组RGC平均记数分别为(19.893.79) /mm和(12.674.12) /mm，轴突密度分别为(94569793) /mm2和(360852

2、85) /mm2，A组明显高于B组(P0.01)。伤后3dA组伤眼与健眼FVEP幅值比由48%上升至88%，8周时仍为78%，各时间点均明显高于B组(P0.01)。结论乳兔SC能够提高成兔视神经挫伤后RGC存活率，减轻轴突变性，显著促进视神经功能恢复，对视神经挫伤修复具有明显的促进作用。【关键词】视神经/病理学；眼损伤；雪旺氏细胞；神经元；疾病模型，动物中分类号：R77912R338-332文献编码：A文章编号：1005-1015(2000)02-0091-03 Effects of neonatol rabbit Schwann cells on promoting repair of op

3、tic nerve contusion in adult rabbitsCAI Li,HUI Yannian,MA Jixian,et al（Department of Ophthalmology,Xijing Hospital,the 4th Militay Medical University,Xian 710032,China）【Abstract】ObjectiveTo study the effects of neonatol rabbit Schwann cells(SC) on repair of optic contusion in adult rabbitsMethods24h

4、 after the adult rabbit optic nerves was contused,0.1 ml of SC suspension(group A)and saline water(group B)were injected into the vitreous of injured eyes respectively.All the animals were studied by retinal ganglion cell(RGC) and axon counting,flash visual evoked potential(FVEP)tests at various int

5、ervals after injury.ResultsAt the 4th week after injury,the number of RGC was(19.893.79)/mm in group A and (12.674.12)/mm in group B,and the density of axons was(94569793)/mm2 in group A and (36085285)/mm2 in group B.There was dramatical difference between group A and B(P0.01).The amplitude of FVEP

6、wave of group A increased from 48% to 88% on the 3rd day after injury,and still dept 78% at the 8th week and group A was significantly higher than group Bat various intervals(P0.01).ConclusionSC are effective in promoting the repair of optic nerve contusion by increasing the survival rate of RGC,res

7、cuing axons from degeneration,and dramatically promoting the function of the optic nerve.【Key words】Optic nerve/pathology；Eye injnries;Schwann cells;Neurons;Disease models,animal成年哺乳动物视神经属于中枢神经系统(central nervous system,CNS)的一部分，损伤后常引起不可逆性视力丧失，目前临床缺乏有效治疗措施。促进视神经损伤后修复再生是临床和基础研究共同关注的热点，视神经损伤后体内或体外应用各类神

8、经营养因子(neurotrophic factors,NFs)改善神经再生微环境已有报道1，但关于雪旺细胞(SC)对神经损伤后修复过程的影响未见有报道。本实验观察了成兔眼内注入乳兔SC对视神经挫伤修复的作用。1材料和方法11乳兔SC培养用文献2的方法得到90%纯度的单层SC后，0.125%的胰酶消化制成SC悬液，改良依格培养液漂洗并离心，调整细胞密度至3106个/ml，立即使用。12成兔视神经挫伤模型的建立健康杂色家兔25只，846合剂(解放军兽医研究所研制，01ml/kg)麻醉后固定于兔板上，选左眼为致伤眼，右眼作为正常对照眼。05%的卡因表面麻醉，用自制致伤头沿眶缘内侧向眶尖部深入约172

9、0 cm，触及视神经孔，稳定致伤头与兔头部后，将重80 g的钢球从与致伤头平行接触，长1 m，与水平线成45夹角的玻璃管内落向致伤头，致伤能量0.55 J。于伤后4h测兔双眼闪光视觉诱发电位(FVEP)，伤眼与健眼FVEP幅值比下降至40%60%时纳入实验，共有20只兔符合条件纳入本实验。13动物分组与处理按伤后治疗方法不同将20只兔随机分为A、B组，每组10只兔。A、B组分别随机确定6只兔眼做病理检查，4只兔眼进行视觉电生理检测。A组伤后24 h，05%的卡因麻醉伤眼，行前房穿刺抽取前房液01 ml后，间接检眼镜下自颞上方角膜缘后2 mm,向玻璃体腔中后部视网膜前方注入SC悬液01 ml，共

10、3105个细胞；B组同样方法注入生理盐水0.1 ml。14检查方法141视网膜RGC记数及SC鉴定A、B组分别于伤后3d、1、2、3、4、8周处死1只兔做病理检查。摘除眼球后去除眼前节，保留后玻璃体膜，将视网膜固定于眼球固定液中，4h后由视盘边缘开始向颞侧切分为、3区，各区长约15 cm，宽约05 cm。石蜡包埋后各区均由靠近视盘一侧开始连续切片，各取前4张切片；其中3张作常规尼氏染色，在高倍镜(物镜40倍)下选取RGC层细胞最密集的区域行RGC记数，每片连续数2个视野；1张作抗S-100抗体(Sigma)的常规免疫组织化学染色。142视神经Glee染色记数A、B组伤后第4、8周处死动物后取球

11、后视神经5 mm，石蜡包埋后作纵行及横行切片，常规Glee染色，光镜下观察并照相；A、B组4、8周的Glee染色横切片各4张采用真彩色医学像分析仪(北京空军医院)定量检测轴突数目。143FVEP检测A、B组各4只兔分别于伤后4h、3 d、1、2、3、4、8周时进行FVEP检测。用国产VETS-视觉电生理检查系统，采用全视野连续白光刺激，频率2 Hz，光强5档，记录仪通频带为0.1850 Hz，迭加次数100次，放大倍数10。观测指标为FVEP P1波的波幅。15统计学处理采用Microsoft-Excel计算软件处理，分别计算A、B组伤眼不同时间点的RGC记数(/mm)、轴突密度(/mm2)、

12、FVEP幅值比(伤眼/健眼)的平均数和标准差(s)，健眼作为正常对照，行两组资料的t检验或2检验。2结果21RGC记数正常对照兔眼视网膜、3区的RGC平均记数为(42.077.32) /mm，伤后3d、1、2周时A、B组间伤眼RGC平均记数比较差异无显著性意义(P0.05)。3、4周时A组RGC下降速度较B组缓慢，RGC数目明显高于B组(P0.05)。此后A、B组伤眼RGC数目趋于稳定，8周时A、B组之间RGC数目差异仍有显著性意义(t=3.31,P0.01)(表1)。22SC鉴定A组伤后3d4周时均可发现视网膜前有抗S-100染色阳性的SC，细胞散在或聚集分布，细胞核及胞浆均可着色。也可见少

13、量抗S-100染色阴性，核衬染为蓝色的成纤维细胞(1，2)。4周后仍可见到SC，但数目较此前减少。B组3d4周时视网膜前未见有细胞成分。23轴突Glee 染色及像分析正常对照视神经Glee染色，可见纵切面上轴突排列紧密整齐，胶质细胞散在；横切面上轴突呈点状排列，分布均匀，密度约为(124433664)/mm2。伤后4周视神经纵切面显示A组轴突排列较为整齐，没有明显的扭曲变形；B组轴突分布极为稀疏，部分扭曲变形，呈串珠样改变(3，4)。伤后4周A、B组视神经横切面上轴突密度分别为(94569793)/mm2、(36085285) /mm2，伤后8周A、B组视神经横切面上轴突密度分别为(88439

14、684)/ mm2、(53755337) /mm2，A组明显高于B组(P0.01)。24FVEP检测伤后4hA、B组伤眼与健眼FVEP幅值比分别为48%、54%，A、B组间差异无显著性意义(2=0.72,P0.05)。3d时A组伤眼与健眼FVEP幅值比上升至88%，B组下降至47%，A、B组之间差异有显著性意义(2=38.31,P0.01)。18周A、B组伤眼与健眼FVEP幅值比均无明显变化，4周时A、B组分别为87%、56%，8周时分别为78%、45%，A组各时间点幅值均明显高于B组(P0.01)。3讨论传统理论认为视神经损伤后RGC突起受损，神经元胞体出现逆行性退变、坏死。但近年来的国内外

15、研究表明，视神经横断后90%的RGC在损伤后1周时表1视神经挫伤后不同时间A、B组伤眼RGC数目(s)(/mm)Tab.1RGC counts in group A and B at different time after injury(s)(/mm)Groups3 days1 week2 weeks3 weeks4 weeks8 weeksA38.226.4936.674.5728.334.6424.444.5719.893.7919.674.10B39.677.2237.334.2726.444.0719.563.8412.674.1213.443.98t value0.320.450.

16、912.463.883.31Pvalue0.050.050.050.050.010.011A组玻璃体腔内注入SC悬液后1周光镜像。视网膜前可见大量细胞存在HE100Fig.1Light microscopic photograph of group A at the 1st week after injecting SC into the vitreous.Showing lots of cells before the retinaHE1002A组玻璃体腔注入SC悬液后1周抗S-100染色光镜像。视网膜前可见大量抗S-100染色阳性的SC(箭)S-100染色100Fig.2S-100 imm

17、unohistochemistry staining of group A at the 1st week after injecting SC into the vitreous.Showing many S-100 positive SC（arrow） before the retinaS-100 staining4003A组视神经挫伤后4周视神经纵切面光镜像。神经纤维分布排列整齐，无明显变性Glee400Fig.3Longitude section of optic nerve of group A at the 4th week after the optic nerve was in

18、jured.The neurite lining very sparsely and showing no degenerationGlee staining4004B组视神经挫伤后4周视神经纵切面光镜像。神经纤维分布极为稀疏，呈串珠样扭曲变性(箭)Glee400Fig.4Longitude section of optic nerve of group B at the 4th week after the optic nerve was injured.The neurite lining very sparsely and showing severely catenuliform de

19、generation(arrow)Glee staining400表现出典型的凋亡特征，而非坏死特征3。其机制可能是由于视神经损伤后轴浆流运输阻滞，RGC失去靶细胞分泌的下行性NFs调节，使某些原癌基因表达发生变化，导致细胞凋亡发生。体外实验已证明减少NFs会导致半数以上的神经元发生凋亡。由于SC能够合成多种NFs，因此能够避免凋亡程序的启动，提高RGC存活率4，5。本实验中将活化的乳兔SC植入成兔玻璃体腔内1周，A组视网膜前可看到大量抗S-100染色阳性的SC，一直持续到伤后4周，说明SC移植入眼内能够长期存活6。A组伤后24周RGC下降速度较B组缓慢，4、8周时RGC平均记数、轴突密度均显

20、著高于B组，说明视神经挫伤后应用SC，能够有效延缓RGC退变速度，提高RGC存活率，从而阻止轴突继续变性。本实验中A组眼内注入SC后仅3d，伤眼/健眼FVEP幅值比就由伤后的48%上升至88%，14周伤眼/健眼FVEP幅值比已接近正常，并显著高于B组(P0.01)，说明眼内注入乳兔SC明显促进了挫伤视神经功能的早期恢复。据此，我们认为视神经钝挫伤不同于视神经横断伤，挫伤后大量的神经纤维并未离断，临床所见视神经电传导障碍是由于超微结构的某些改变，如髓鞘结构疏松、板层分离、轴浆流运输阻滞等所导致的。由于视神经损伤后神经修复所需要的结构和功能物质，均由胞体合成并通过轴浆转运供给，因此RGC细胞功能状

21、态直接决定了神经超微结构是否能够恢复。本实验中视神经功能迅速恢复的原因可能为：玻璃体腔内植入乳兔SC持续提供大量外源性的NFs，使损伤的RGC避免发生凋亡，恢复正常细胞功能7，及时合成大量轴突修复所需的结构和功能物质供给神经，挫伤视神经修复因而得以顺利进行。但其确切机制还有待于进一步研究。挫伤视神经可部分恢复功能提示促进RGC损伤后的自我修复而非再生，可能是未来治疗视神经挫伤的重要途径之一。(本文编辑：唐健)基金项目：全军九五医药卫生科研基金资助项目作者单位：蔡莉（710032西安，第四军医大学西京医院眼科）惠延年（710032西安，第四军医大学西京医院眼科）马吉献（710032西安，第四军医大学西京医院眼科）郭守一（第四军医大学空医系）参考文献1，Takano M.Axonal regeneration of retinal ganglion cellsJ.Nippon Ganka Gakkai Zasshi,1996,100:972-980.2，蔡莉，惠延年，孟晋宏兔Schwann细胞对视网膜神经元突起生长的作用J中华眼底病杂志，1998，14：212-2143，Berkelaar M,Clarke DB,Wan