人源汉坦病毒疫苗候选株的分离鉴定及其某些特性研究

1、人源汉坦病毒疫苗候选株的分离鉴定及其某些特性研究【摘要】目的对人源汉坦病毒疫苗候选株作分离鉴定及特性的研究。方法用Vero细胞分离病毒，用免疫荧光法作病毒效价测定。用RT-PCR及部分核苷酸序列分析等检定。结果用Vero细胞从安徽省凤台县肾综合征出血热病人血清中分离一株汉坦病毒(HV)，其抗原特性及PCR分型结果证明为汉滩病毒(型病毒)；其免疫血清对来源于不同地区的HV均有中和活性。M片段部分序列分析结果表明，该毒株与76-118等毒株核苷酸序列有较大差异，但氨基酸序列同源性甚高。病毒株对Vero细胞敏感，繁殖高峰一般在9天以后，可多次收获病毒。结论上述特性表明，分离病毒株适合用作研制灭活疫苗

2、后备株。【主题词】出血热，病毒性； 汉坦病毒； 序列分析，DNA； Vero细胞 Isolation,identification and certain characteristics of a Hantaan virus proposed as candidate virus for killed vaccineXIE Yanxiang, HANG Changshou, WANG Hua, et al.（Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052, China）【Abstract

3、】ObjectiveIsolation and identification of a Hantaan virus from HFRS patients serum for killed vaccine development.MethodsThis virus temporally called FT14 detected by IFAT, RT-PCR. Partial sequence of M segment was determined by Sangers dideoxy chain termination method.ResultsThe antigenicity and PC

4、R amplification of the newly isolated virus FT14 proved that it belongs to virus of HTN type. Antiserum to the virus can neutralized many strains of Hantaan virus from different areas. The partial sequence of M segment of FT14, as compared with other HTN strains, showed great differences among nucle

5、otied sequences, while the deduced amino acid sequence is comparatively conservative. The titer of the virus reached its peak at 9 days post inoculation in vitro, then the peak titer could last for a long time. ConclusionThis virus strain FT14 would be a good candidate virus for killed vaccine devel

6、opment.【Key words】Hemorrhagic fever,viral; Hantaan virus; DNA sequencing; Vero cells肾综合征出血热(HFRS)是我国重点防治的急性传染病。安徽省是我国HFRS的老疫区和重疫区。因此，对流行于该地区的汉坦病毒(HV)进行分离和系统的鉴定，能为HFRS的防治提供科学依据。特别是流行株的血清型和基因型的确定，是选择使用疫苗的型别和确定防治重点及对策的前提，也为研究我国汉坦病毒的遗传性及进化提供一定的依据。同时，对毒株的免疫原性、抗原性及其在Vero细胞中增殖特性进行研究，为传代细胞疫苗候选株的选择提供基础材料。1材料

7、和方法TM Taq酶。逆转录酶为GibcoBRL公司的Super ScriptTM 逆转录酶。PCR片段回收使用Promega公司的Wizard?-2接种病毒后，每天收获1瓶，刮取细胞作荧光检查；上清冻存检测病毒滴度；细胞冻化后检测ELISA抗原滴度。1.7实验动物购自中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所。2结果表1FT14抗原检测HFRS病人双份血清结果Tab.1Reactivity of FT14 with paired sera from HFRS patients血清号Serum No.发病后天数Days post onsetof the diseaseIFA抗体滴度*IFA(An

8、tibody titer)*FT1476-11884 FLi1A*3408040C*191 2801 2806402A4808040C201 2801 2801 2803A3404040C186401 280640 *A：急性期(Acute phase)?*C：恢复期(Convalescent phase)?*以血清稀释度的倒数表示(Reversion of the serum dilution titer) 表2FT14抗原及其免疫血清与其他毒株交叉中和试验Tab.2Cross plaque-reduction neutralization test between FT14 and oth

9、er virus strains病毒株Strain免疫血清中和滴度PRNT titers of immune sera微量细胞病变中和试验MCPENTL99R22Chen76-118FT14FT14C41010160160160160Chen201032032032032084 FLi1010160320320320FT142010160160640320H52010160160160160H3201016016016016076-1182010160640320320A9402080808080L993208020202040R2216016010101020 表3FT14在Vero细胞中的

10、传代情况Tab.3Passages of FT14 on Vero cells传代Passage感染后天数Days postinfection抗原检测Detection of antigenIFAELISAPFU/ml123ND220+11510237+164510547+1128610557+12565106表4FT14在Vero细胞上的增殖动态Tab.4The multiplication of FT14 on Vero cells感染后天数Days postinfection抗原检测Detection of antigenIFAELISAPFU/ml3ND21006+13251059+1

11、128610612+1256710615+1256610618+1256710621+1256110724+12561107 1FT14在Vero细胞上的繁殖曲线Fig.1Growth curve of virus FT14 on Vero cells2.5RT-PCR对FT14扩增及鉴定用型引物从29份病人血清中扩增出阳性带8份，其中包括分离出FT14毒株的血清。29份病人血清与型引物均不反应。2.6FT14部分M片段核酸序列测定测得了对应于M基因组片段2 0032 302位的300碱基对的核苷酸序列(见2)，并就核苷酸序列及推导的氨基酸序列与一些已知序列进行了比较(见表5)，结果FT14与

12、HTN型病毒株核苷酸序列的同源性为81.0%82.3%；推导的氨基酸序列同源性为96%。 2FT14病毒M片段部分核苷酸序列Fig.2Partial nucleotide sequence of M segment of FT14 virus表5FT14M片段部分核苷酸序列及推导的氨基酸序列与已知病毒相应片段序列的同源性(%)Tab.5Comparison of partial nucleotide and amino-acid sequences of M segment among FT14 and other known virusesFT1476-118ChenR22FT1482.38

13、1.069.076-11896.086.770.0Chen96.097.068.7R2276.879.878.8 注：空白对角线上为核苷酸序列，下为氨基酸序列Note:The upper part of diagonal represents nucleotide sequence, the lower part the amino acid sequence 3讨论用Vero细胞作为疫苗生长的基质，是当前HFRS疫苗发展的方向6。我国以Vero细胞为基质的HFRS疫苗尚处于实验室开发阶段，迫切需要在Vero细胞上繁殖力高的适应病毒株。FT14因其用Vero细胞分离、适应性好、滴度高而具备上述

14、条件。和鼠源病毒株相比，尽管核苷酸序列有较大差异，但氨基酸序列差别不大，这表明了在HV进化过程中其结构蛋白氨基酸序列保持相对稳定的特点，也决定了FT14具有相对稳定的抗原性。而且其来源及传代历史清楚，有可能适合作为Vero传代细胞型疫苗候选株。作者单位：解燕乡（100052北京，中国预防医学科学院病毒学研究所出血热与虫媒病毒室）杭长寿（100052北京，中国预防医学科学院病毒学研究所出血热与虫媒病毒室）王华（100052北京，中国预防医学科学院病毒学研究所出血热与虫媒病毒室）朱公文（安徽省凤台县人民医院）参考文献2，Lee HW, Lee PW, Johnson KM. Isolation of the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever. J Infect Dis,1978,137:298-308.4，Schmaljo